МУ 3.3.2.2124-06 Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза

     
6.1. Контроль питательных сред для выделения, культивирования
 и идентификации возбудителя чумы

6.1.1. Тест-штаммы

Для бактериологического контроля питательных сред, предназначенных для культивирования и выделения возбудителя чумы, используют штаммы Yersinia pestis EV, Yersinia pestis P-1680 - Закавказского горного очага и Yersinia pestis И-2377 - Горно-Алтайского очага.

В качестве тест-штамма при контроле ингибиторов посторонней микрофлоры используют Escherichia coli 18, Bacillus cereus 8 и Proteus vulgaris HX 19 N 222. Тест-штаммы получают из ГИСК им. Л.А.Тарасовича через Государственную коллекцию патогенных бактерий "Микроб".

При бактериологическом контроле сред для идентификации чумного и псевдотуберкулезного микробов по признаку ферментации мочевины и углеводов (ЦДС) используют тест-штаммы Yersinia pestis EV и Yersinia pseudotuberculosis И-199, который получают из Иркутского НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока.

6.1.2. Порядок, хранения тест-штаммов

Тест-штаммы Y. pestis EV, Y. pestis P-1680, Y. pestis И-2377, E. coli 18, P. vulgaris НХ19 N 222, В. cereus 8 и Y. pseudotuberculosis И-199 хранят в лиофилизированном состоянии при температуре (5±1) °С до сохранения их свойств согласно п.6.1.3. Рабочие субкультуры хранят в 0,4%-м агаре Хоттингера рН 7,2±0,1 (по МУК 4.1/4.2.588-96, с.46) под слоем стерильного вазелинового масла или на скошенном агаре Хоттингера рН 7,2±0,1 в запаянных пробирках при температуре (5±1) °С.

Пересевы культур проводят не менее 1 раза в 3 мес., но не более четырех раз. По истечении этого срока для работы вскрывают новую ампулу с культурой.

6.1.3. Требования к тест-штаммам

Тест-штаммы Y. pestis EV, Р-1680 и И-2377 должны обладать типичными культурально-морфологическими и биохимическими свойствами, лизироваться чумным бактериофагом Л-413С. По морфологии - должны быть грамотрицательными палочками, на агаре образовывать колонии R-формы, в бульоне - рыхлый осадок с прозрачной надосадочной жидкостью. Биохимические свойства - должны ферментировать глюкозу, маннит и мальтозу, штамм Y. pestis EV не должен разлагать глицерин и рамнозу; штаммы Р-1680 и И-2377 должны ферментировать рамнозу и глицерин. Штамм Y. pestis EV при температуре выращивания (28±1) °С нуждается в аминокислотах - фенилаланине, метионине, треонине и цистеине; Y. pestis И-2377 - в фенилаланине, цистеине, аргинине и лейцине; Y. pestis Р-1680 - в фенилаланине, метионине и тиамине (витамин В). При работе с тиаминзависимыми штаммами Р-1680 Закавказского горного очага в питательные среды следует добавлять витамин В (0,0001 мг на 100 мл среды) или среду 199 (3 мл на 100 мл среды).

Тест-штамм Y. pseudotuberculosis И-199 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам, лизироваться псевдотуберкулезным бактериофагом. На агаровых средах при температуре (28±1) °С тест-штамм псевдотуберкулезного микроба растет в виде бугристых хромогенных колоний, в бульоне - равномерное помутнение; в мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм должен ферментировать глюкозу, арабинозу, маннит, рамнозу, мочевину; не должен расщеплять лактозу, сахарозу; должен обладать подвижностью.

Тест-штамм Р. vulgaris НХ 19 N 222 должен быть типичным по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. В бульоне через 18-24 ч роста при температуре (37±1) °С - равномерное помутнение с пленкой на поверхности, на агаровых средах - в виде мутных сероватых роящихся колоний. В мазках - грамотрицательные палочки. Тест-штамм Р. vulgaris должен ферментировать с образованием кислоты и газа глюкозу, маннозу, сахарозу и не расщеплять маннит и арабинозу.

6.1.4. Подготовка тест-штаммов

Культуры каждого тест-штамма из ампулы или со среды хранения пересевают в пробирку с бульоном Хоттингера рН 7,2±0,1 (МУК 4.1/4.2.588-96, с.45) и на чашки Петри с агаром Хоттингера рН 7,2±0,1. Посевы с Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 инкубируют при температуре (28±1) °С в течение (48±1) ч; посевы с Е. coli 18, Р. vulgaris HX19 N 222 и В. cereus 8 - при температуре (36±1) °С в течение (24±1) ч. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяют визуально на чистоту роста и пересевают на скошенный в пробирках питательный агар. В случае отсутствия роста на питательной среде для последующего пассажа используют культуру, выращенную на питательном бульоне. После инкубации посевов Y. pestis EV, Y. pestis Р-1680, Y. pestis И-2377 и Y. pseudotuberculosis И-199 при температуре (28±1) °С и Е. coli 18, Р. vulgaris HX19 N 222 и В. cereus 8 - при температуре (36±1) °С в течение (24±1) ч, культуры используют для контроля питательных сред.

Для посева на испытуемые среды используют культуры тест-штаммов не более 3-4 пассажей на питательных средах.

Из суточных агаровых культур тест-штаммов готовят взвесь в 0,9%-м растворе натрия хлорида рН 7,1±0,1 концентрацией 1х10 м.к./мл Y. pestis, Y. pseudotuberculosis и P. vulgaris по стандартному образцу мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича ОСО 42-28-85П 10 единиц и делают 10-кратные последовательные разведения, перенося 0,5 мл взвеси в 4,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида до разведения 10(1х10 м.к./мл), тщательно перемешивая и меняя стерильную пипетку после переноса квоты каждого разведения.

6.1.5. Определение показателя прорастания и чувствительности плотных
и жидких питательных сред и скорости роста на них возбудителя чумы

Контроль жидких сред. Культуру из разведении 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) вносят по 0,1 мл в 3 пробирки с 10 мл жидкой питательной среды. Контролем служит заранее отконтролированный бульон.

Контроль плотных сред. Культуру из разведения 10(1х10 м.к./мл) и 10(1х10 м.к./мл) наносят по 0,1 мл на 3 свежеприготовленные и хорошо подсушенные агаровые пластинки. Взвесь распределяют по поверхности агара покачиванием чашки Петри. Контролем должен служить заранее отконтролированный агар.

Учет результатов. Учет результатов проводят через 24 и 48 ч инкубации при температуре (28±1) °С. Жидкие питательные среды считают пригодными для использования в диагностических целях, если через 24 ч в бульоне появляется видимый рост культуры, а через 48 ч - интенсивный рост чумного микроба во всех пробирках при высеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10) и в одной из пробирок при посеве 1х10 м.к. на 10 мл среды (разведение 10).

Плотные питательные среды должны обеспечивать рост чумного микроба через 48 ч инкубации на всех агаровых пластинках при высеве 10 м.к., показатель прорастания при высеве 100 м.к. должен быть не менее 50%. Начальный рост чумного микроба ("кружевные платочки") должен быть через 24 ч инкубации; типичные колонии диаметром не менее 1 мм - через 48 ч. Морфология микробов - грамотрицательные биполярные полиморфные палочки.

6.1.6. Определение показателя эффективности

Плотные питательные среды. Готовят взвесь Y. pestis EV из суточной агаровой культуры с концентрацией 5х10 м.к./мл, эквивалентную 5 единицам стандартного образца мутности ОСО 42-28-85П. По 0,1 мл этой взвеси засевают на 2 пробирки с 5 мл скошенного испытуемого агара (в нижней части пробирки не должно быть столбика). Через 48 ч инкубации при температуре (28±1) °С культуру смывают с поверхности агара 2,5 мл 0,9%-го раствора натрия хлорида. К 0,5 мл полученной взвеси мерно добавляют 0,9%-й раствор натрия хлорида до концентрации 1х10 м.к./мл, эквивалентной 10 единицам ОСО 42-28-85П. Например, на 0,5 мл взвеси, смытой со скошенного агара, пошло 3,2 мл растворителя; всего в пробирке будет 0,5 мл + 3,2 мл=3,7 мл. Выход с 1 мл среды - 3,7х10 м.к.