МУ 1.1.578-96 Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы

3. Постановка исследований по выявлению аллергенных свойств

3.1. Внутрикожная сенсибилизация морских свинок

В эксперименте используют молодых морских свинок массой 250-300 г, разделенных на 2 опытных и одну общую контрольную группы по 8-10 животных в каждой. Животных опытных групп сенсибилизируют, вводя однократно в кожу наружной поверхности уха ближе к его основанию 50 (I-я опытная группа) и 200 мкг на животное (2-я опытная группа) изучаемое вещество в объеме 0,02-0,1 мл. В качестве растворителей применяют дистиллированную воду, физиологический раствор, ацетон, спирт, твин-80, диметилсульфоксид и др. При изучении маслообразных продуктов используют водные эмульсии, а для отвержденных полимеров - вытяжки (см. раздел 5.3). Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, эмульгатор или экстрагирующую жидкость.

Выявление сенсибилизации (см. раздел 5) проводят через 8-10 дней. Сильные аллергены в обеих дозах вызывают у морских свинок выраженную сенсибилизацию: среднегрупповой показатель аллергологических тестов статистически достоверно отличается от такового у контрольных животных. Умеренные аллергены выраженную сенсибилизацию вызывают лишь при введении в дозе 200 мкг на животное, а при введении 50 мкг на животное - слабую, при которой сенсибилизация обнаруживается у 1/3-1/2 части животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов могут не отличаться от таковых у контрольных животных. Слабые аллергены вызывают слабую сенсибилизацию лишь при введении вещества в дозе 200 мкг на животное, при этом положительными могут быть лишь тесты с клетками крови, а кожные пробы - отрицательными.

3.2. Комбинированная сенсибилизация морских свинок

Сложные продукты и неотвержденные полимеры могут очень плохо всасываться, и в этом случае сенсибилизация у морских свинок не наступает даже при введении в кожу уха 200 мкг/жив. Для окончательного решения о наличии аллергенных свойств при отрицательных результатах аллергологического тестирования животных на следующий день начинают эпикутанные аппликации вещества. После 7-й аппликации повторно проводят тестирование морских свинок.

Концентрацию вещества для эпикутанных аппликаций подбирают в процессе изучения раздражающего кожу действия или в специальном эксперименте: 6-8 морским свинкам массой 250-300 г в течение 7-10 дней (по 5 раз в неделю) наносят по 3 капли изучаемого вещества и его разведений 1:2, 1:10 и 1:100 на выстриженные "окошки" боковой поверхности туловища размером 2x2 см. В качестве растворителя удобно использовать летучий, не раздражающий кожу растворитель (ацетон, 70°-ный спирт, диметилсульфоксид). Если образуется пленка, то ее через 4 часа смывают, в остальных случаях кожу ничем не обрабатывают. Из нерастворимых веществ готовят мази (лучше на ланолине, а не на вазелине), которые распределяют глазной лопаточкой по поверхности "окошка". Для сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию, не вызвавшую развития контактного дерматита.

3.3. Определение ГЗТ на мышах

В опытную и контрольную группы берут по 10 мышей чистой линии (BALB/C, СА-1, ДВА/2) или по 16-20 белых беспородных мышей массой 18-20 г. Животных сенсибилизируют 10 мМ или 100 мкг изучаемого вещества однократно внутрикожно в основание хвоста. Сенсибилизирующая доза вещества эмульгируется в 60 мкл смеси полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) и раствора Хенкса рН 7,5, приготовленной в соотношении 1:1. Состав ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой нагреванием вакцины БЦЖ. В этот объем ПАФ добавляют 50 мкл твина-20 и 0,5 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют. Контрольным животным вводят 60 мкл данной смеси без добавления изучаемого вещества.

Для выявления сенсибилизации через 5 суток в подушечку задней лапы мышей вводят такое же, как и при сенсибилизации, количество изучаемого вещества (10 мМ или 100 мкг), растворенного (взвешенного) в растворе Хенкса. Через 24 часа измеряют инженерным микрометром МК-0-25 толщину обеих задних лап в мм. О величине отека, т.е. о развитии ГЗТ, судят по разнице в толщине обеих задних лап (показатель ГЗТ). У контрольных животных она, как правило, составляет 0,04-0,09 мм. Статистически достоверное превышение среднегруппового показателя ГЗТ опытных животных по сравнению с контрольными свидетельствует о наличии выраженных или умеренных сенсибилизирующих свойств у изучаемого соединения.

3.4. Многократные эпикутанные аппликации на морских свинках

Подбор сенсибилизирующей концентрации осуществляют так же, как при комбинированной сенсибилизации (см. раздел 3.2). Эпикутанные аппликации проводят по 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20 аппликаций). Если на 2-3-й неделе опыта у морских свинок появляются признаки контактного дерматита, то сенсибилизирующие аппликации продолжают на другом участке кожи. Выявление сенсибилизации проводят через 1-2 суток после последней аппликации. При этом капельную кожную пробу ставят на противоположном боку.