МУ 3.3.2.1758-03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа

3.2. Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
с вирусом гриппа (микрометод)

Принцип метода, его учет и ингредиенты для реакции, проводимой микрометодом, те же, что и для проведения РТГА макрометодом. Изменяются только концентрации и объемы ингредиентов.

Реакцию ставят на микропанели с "U"-образными лунками.

3.2.1. Приготовление 0,5%-ной взвеси эритроцитов петуха

Взвесь готовят из 1%-ной суспензии эритроцитов (см. макрометод) разведением ее в 2 раза (т.е. в соотношении 1:1) буферно-солевым раствором.

3.2.2. Определение гемагглютинирующего титра антигена

В каждую лунку микропанели вносят буферно-солевой раствор в объеме 50 мкл. Затем в первую лунку вносят 50 мкл антигена в разведении 1:10 и далее проводят титрование по принципу двукратного разведения. Из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят по 50 мкл 0,5%-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием и оставляют при комнатной температуре (20±2) °С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле (см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена или одну агглютинирующую единицу (1 АЕ) принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов на 3 или 4 креста.

Определение титра антигена сопровождается постановкой отрицательного контроля на отсутствие спонтанной агглютинации эритроцитов. В качестве отрицательного контроля служат несколько лунок панели, в которые вместо антигена внесен буферно-солевой раствор.

3.2.3. Приготовление рабочей дозы антигена

Рабочая доза антигена при постановке РТГА микрометодом равна 8 ГАЕ. Для ее приготовления гемагглютинирующий титр делят на 16. Полученная цифра означает, во сколько раз необходимо развести антиген.

Пример. Титр антигена равен 1:160. Разделив 160 на 16, получаем цифру 10, указывающую, что антиген необходимо развести в 10 раз.

Перед постановкой основного опыта проверяют точность приготовления рабочей дозы (8 АЕ). Для этого в шесть лунок микропанели, начиная со второй, вносят по 25 мкл буферно-солевого раствора. В 1-ю и 2-ю лунки добавляют по 25 мкл приготовленной рабочей дозы антигена. После перемешивания смеси 25 мкл ее объема переносят из 2-й лунки в 3-ю, из 3-й - в 4-ю и т.д. Из последней лунки панели 25 мкл удаляют. Затем во все лунки добавляют по 25 мкл буферно-солевого раствора и по 50 мкл 0,5%-ной суспензии эритроцитов. После встряхивания смесь оставляют при температуре (20±2) °С на 40-45 мин до оседания эритроцитов в контроле.

При правильном выборе рабочей дозы агглютинация эритроцитов должна наблюдаться только в четырех лунках панели. В остальных лунках агглютинация должна отсутствовать. В случае отклонения от указанного результата добавляют антиген или буферно-солевой раствор для получения необходимой рабочей дозы.

3.2.4. Постановка реакции торможения гемагглютинации

Постановка реакции микрометодом соответствует описанному для макрометода, за исключением объемов используемых ингредиентов реакции.

Готовят двукратные разведения сыворотки в объеме 25 мкл, вносят рабочую дозу антигена (8 АЕ) в объеме 25 мкл и после контакта антигена и сыворотки (от 30 мин до 1 ч) при температуре (20±2) °С в каждую лунку панели вносят по 50 мкл 0,5%-ной взвеси эритроцитов. После оседания эритроцитов в контроле (как правило, через 40-45 мин) проводят учет результатов.

За титр активности принимают разведение сыворотки, при котором отсутствует агглютинация эритроцитов.