МУ 3.3.2.1758-03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа

4. Метод определения инфекционной активности вируса гриппа
на куриных эмбрионах

Определение проводят на развивающихся куриных эмбрионах 10-12-дневного возраста.

Десятикратные разведения вируса (вакцины) готовят в 4,5 мл буферно-солевого раствора рН от 7,4 до 7,0, меняя при каждом разведении пипетку.

Вводят в аллантоисную полость 0,2 мл вируссодержащей жидкости из разведений от 10 до 10 (разведения могут меняться в зависимости от целей исследования и предполагаемой инфекционной активности вируса), используя на каждое разведение по 4 эмбриона. Для заражения эмбрионов используют разные шприцы или проводят заражение одним шприцем, начиная с большего разведения.

Эмбрионы инкубируют при температуре 35 °С в течение 48 ч для вируса гриппа (вакцины) типа А и 72 ч для вируса гриппа (вакцины) типа В. По истечении срока инкубации отдельно из каждого эмбриона отбирают по 0,4-0,5 мл аллантоисной жидкости, которую помещают в 4 отдельные лунки плексигласовой доски. Затем в каждую лунку добавляют по 0,4-0,5 мл 1%-ной суспензии куриных эритроцитов. Через 30-40 мин контакта при температуре (20±2) °С, после оседания эритроцитов в контроле, проводят учет гемагглютинации.

Контроль: проводят как описано выше, но вместо аллантоисной жидкости из куриного эмбриона в свободные 4 лунки панели вносят по 0,4-0,5 мл буферно-солевого раствора рН 7,2±0,2.

Вычисление биологического титра проводят по методу Рида и Менча.

Метод основан на логической предпосылке, что тканевая культура или животное, погибшие при заражении их каким-либо разведением вируса, погибнут и при заражении любым более низким разведением.

Пример подсчета показан ниже.

Подсчет 50%-ной дозы (ТЦД) по методу Рида и Менча

Из таблицы видно, что 50%-ная доза находится между разведениями вируса 10 и 10.

Далее расчет величины , которую необходимо прибавить к разведению непосредственно ниже 50%-ной дозы (), производится по следующей формуле:

,

где - процент гибели при разведении, непосредственно ниже искомой 50%-ной дозы (в данном случае 60%);

- процент гибели при разведении непосредственно выше искомой 50%-ной дозы (в данном случае 17%).

Подставляя полученные значения в формулу 1, находим:

, откуда

титр вируса (в обратных ) равен

6+0,23=6,23,

другими словами, одна ТЦД или LD соответствует разведению вируса 10.

Если в титрование были взяты разведения вируса с интервалом 0,5, то величину в формуле 1 следует умножить на 0,5.

Поскольку при титровании вируса в пробирочных культурах обычно получаются четкие результаты и культуры со 100%-ной дегенерацией отделены от культур с полным отсутствием дегенерации всего одним разведением вируса, удобно пользоваться при подсчете титров по Риду и Менчу упрощенной схемой.