МУ 3.3.2.1758-03 Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа

     
3.1. Метод постановки реакции торможения гемагглютинации (РТГА)
с вирусом гриппа (макрометод)

Реакцию торможения гемагглютинации применяют для установления типа и подтипа вируса, т.е. специфичности, а также для определения нарастания титров специфических антител.

Постановка РТГА включает следующие этапы работы: приготовление взвеси эритроцитов, определение гемагглютинирующего титра антигена в РГА и рабочей дозы вируса, постановка самой реакции.

Для постановки реакции необходимы следующие ингредиенты:

- антиген (вакцина, вируссодержащая жидкость - аллантоисная или культуральная);

- иммунные сыворотки к различным вирусам гриппа;

- буферно-солевой раствор рН 7,2±0,2 (Na-фосфатный буфер 0,01 M c 0,16 M NaCl);

- взвесь куриных эритроцитов, 1%.

3.1.1. Приготовление взвеси куриных эритроцитов

Для постановки РТГА используют эритроциты петухов. Кровь у петухов берут из сердца или подкрыльцовой вены.

Свежеполученную от 3-5 петухов кровь помещают во флакон со стеклянными бусами или же с одним из антикоагулянтов (раствор Альсевера, 5%-ный раствор лимонно-кислого натрия). Дефибринирование крови проводят немедленно путем интенсивного встряхивания флакона в течение 5-7 мин при температуре (20±2) °С до выпадения волокон фибрина.

Дефибринированную кровь фильтруют через 4 слоя марли, затем трехкратно отмывают буферно-солевым раствором (на 1 объем крови - 4 объема буферно-солевого р-ра) путем центрифугирования при (800±200) об./мин в течение (15±5) мин. Надосадочную жидкость удаляют. Из осадка, принимаемого за 100%, готовят 1%-ную суспензию куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования на ФЭК-56.

3.1.2. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов с помощью фотоколориметрирования

Для получения стандартных концентраций эритроцитарных суспензий рекомендуется использовать фотометрический метод, позволяющий определять их концентрацию по величине оптической плотности. Основанием для этого служит наличие линейной зависимости между оптической плотностью и концентрацией эритроцитов в определенном интервале концентраций - от 0,15 до 1,00%.

Величину оптической плотности для 1%-ной суспензии куриных эритроцитов определяют экспериментально, в ряду нескольких (~20) параллельных проб с последующим вычислением среднеарифметической величины, принимаемой за исходный показатель оптической плотности.

3.1.3. Определение показателя оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов

Для приготовления одной пробы отбирают градуированной пипеткой 0,2 мл осадка эритроцитов в емкость, содержащую 19,8 мл буферно-солевого раствора; содержимое тщательно перемешивают, заполняют им объем прямоугольной кюветы фотоколориметра (толщина слоя =1 мм) и немедленно измеряют оптическую плотность суспензии при длине волны нм.

В качестве контрольного раствора используют дистиллированную воду, предварительно заполняя ею объем второй такой же кюветы ФЭК.

3.1.4. Приготовление 1%-ной суспензии куриных эритроцитов по показателю оптической плотности

Готовят требуемое количество суспензии куриных эритроцитов несколько большей, чем 1%-ной концентрации. Добавлением буферно-солевого раствора рН 7,2±0,2 к полученной суспензии и измерением оптической плотности ее на ФЭК доводят концентрацию суспензии до такой, показатель оптической плотности которой равен величине, определенной ранее (п.3.1.2).

Примечание. Поскольку значение оптической плотности суспензии эритроцитов может изменяться в зависимости от качества эритроцитов (на что влияет сезон года, климатические условия, состояние и возраст животных и т.п.), а также зависит от технических характеристик измерительного прибора (ФЭК), величину оптической плотности 1%-ной суспензии куриных эритроцитов следует определять периодически (1 раз в 3-4 месяца) и на одном и том же приборе.

3.1.5. Определение гемагглютинирующего титра антигена

В лунках плексигласовой планшеты готовят двукратные разведения антигена в объеме 0,4 мл на буферно-солевом растворе, начиная с 1:10 до 1:1280. В каждую лунку вносят по 0,4 мл 1%-ной суспензии эритроцитов. Содержимое лунок перемешивают встряхиванием планшеты и оставляют при температуре (20±2) °С на 40-45 мин (до оседания эритроцитов в контроле, см. ниже).

Реакцию оценивают по четырехкрестовой системе. За титр антигена, или одну агглютинирующую единицу (1АЕ), принимают наибольшее разведение антигена, дающее четко выраженную агглютинацию эритроцитов (3 или 4 креста).