МУ 3.1.1029-01 Отлов, учет и прогноз численности мелких млекопитающих и птиц в природных очагах инфекций

6.3. Сбор материала для вирусологических исследований (млекопитающие, птицы)

     6.3.1. Общие положения

В качестве источников выделения арбовирусов известны представители всех четырех классов наземных позвоночных - амфибий, рептилий, птиц и млекопитающих. Из них наиболее важную роль в носительстве вирусов и в прокормлении членистоногих переносчиков в природных очагах арбовирусных инфекций играют птицы и млекопитающие.

При определении роли позвоночных животных в циркуляции арбовирусов основное применение нашли серологические и вирусологические методы. Соответственно, в первом случае собирают сыворотки крови, во втором - сгустки крови, пробу головного мозга и кусочки печени, сердца, почки, селезенки, в которых отмечается высокая концентрация попавшего в организм арбовируса. В случае исследования материала на миксовирусы берут также кусочки легкого и трахеи в области бифуркации (место разделения трахеи на бронхи).

Особенности добычи и подготовки позвоночных для исследований на арбовирусы заключаются прежде всего в том, что материал должен быть взят или прижизненно (взятие крови для серологических исследований), или тотчас после умерщвления особи (пробы внутренних органов) с максимальным соблюдением правил, обеспечивающих стерильность взятых проб. Поэтому наиболее распространенный способ добычи мелких млекопитающих - отлов плашками Геро - следует заменить отловом живоловками или канавками (заборчиками), а если это исключено, плашки необходимо проверять каждые 1-2 ч.

Отстрелом животных для получения вирусологического материала пользуются лишь в крайних случаях, при невозможности применения других методов. В этом плане уместно рекомендовать иммобилизацию (обездвиживание) особей с помощью мышечных релаксантов. Для обездвиживания млекопитающих средних и крупных размеров надежные результаты дает метод активной дистанционной иммобилизации, при которой в качестве действующего вещества весьма эффективен дитилин. Отлов некоторых видов стайных птиц (сизых голубей, грачей и др.) можно проводить с использованием оральных иммобилизирующих веществ, в частности этаминал-натрия совместно с тазепамом, в смеси с приманкой*.

________________

* Оптимальная доза для сизых голубей - 0,25 г этаминала-натрия и 0,05 тазепама на 100 г прикорма.

6.3.2. Взятие материала от мелких млекопитающих

Мелкие млекопитающие (преимущественно грызуны) часто бывают основным объектом исследований при эпизоотологическом мониторинге за природными очагами многих зоонозных инфекций, в т.ч. и вирусной этиологии. Для проведения серологических анализов на инфицированность позвоночных животных арбовирусами требуется, как правило, 1,0-1,5 мл сыворотки, которую в таком объеме получают из 4-5 мл крови. Однако у мелких грызунов цельной крови обычно удается взять не более 1,5-2,0 мл. Поэтому, если нет задачи исследовать животных индивидуально, в пробу с одной точки отлова объединяют 2-3 особи одного вида, пола и желательно возраста.

Зверьков после умерщвления вскрывают в течение 5-7 мин. Для этого готовят 2 пары ножниц и пинцетов. Одной парой вскрывают кожу (фартуком), второй - грудную клетку, рассекая на несколько частей сердце, и стерильным шприцем забирают кровь. Ее сливают в пробирку по стеклу и, набрав 4,5-5,0 мл, ставят при температуре 20 °С на 30-60 мин для образования сгустка. Затем сгусток обводят стерильной пастеровской пипеткой или прокаленной на огне стальной спицей, чтобы отделить его от стенок пробирки. После обведения сгустка пробирки закрывают резиновыми пробками и ставят в прохладное место (холодильник или на лед). Оптимальная температура - 0 °С. Если нет холодильника, пробирки можно сохранять, обернув их мокрым материалом и поместив в тень или на сквозняк. Через 4-6 ч сыворотку крови отсасывают стерильными пастеровскими пипетками и переносят в стерильные емкости (пенициллиновые или инсулиновые флаконы, виалки и др.). Сыворотку хранят в холодильнике (или замораживают в сосуде Дьюара). При длительном хранении в холодильнике в сыворотку добавляют консервант (мертиолят натрия 1:10000), чтобы ингибировать постороннюю микрофлору. Длительное хранение без холодильника недопустимо. Пробирки и флаконы заранее этикетируют. На этикетке указывают номер пробы, дату забора крови, вид животного, его пол и возраст (число особей, если от нескольких зверьков), адрес отлова. Эти данные должны совпадать с данными в журнале, где дополнительно записывают, были ли сняты с животного эктопаразиты (если да, то указывают их таксономическую принадлежность и количество).

После взятия крови в первую очередь берут головной мозг, затем сгустки крови и кусочки внутренних органов. При заборе пробы головного мозга первой парой инструментов снимают шкуру, разрезая кожу затылочной области на уровне 1-2 шейных позвонков. Кожу срезают по бокам до конца лба и откладывают ее вперед. Края разрезанной кожи и череп обрабатывают 70° спиртом или, в крайнем случае, 5%-ным йодом. Второй парой инструментов срезают по шву верхнюю часть черепа и снимают ее, оголяя головной мозг. Браншами ножниц (стерильных) забирают кусочки мозга и над пламенем спиртовки помещают в стерильный флакон, этикетируют, затем сразу же замораживают в сосуде Дьюара.

Для взятия проб внутренних органов также пользуются двумя парами инструментов. Кусочки органов должны быть объемом 1-1,5 см. Пробы каждого органа складывают в отдельные стерильные флаконы, сопровождают соответствующими этикетками и помещают в сосуд Дьюара, где они хранятся до момента исследования.

От животных, добытых давилками или капканами, материал следует брать не позже 2 ч после их гибели (поимки), т.к. в более поздние сроки антигены арбовирусов (особенно в головном мозге) начинают распадаться.

6.3.3. Взятие материала от птиц

При получении материала от птиц для серологических исследований на арбовирусные инфекции особого внимания заслуживает прижизненное взятие крови. Чтобы исключить гибель особи, возможное количество взятой крови (по принятым нормам) не должно превышать 5-9% от ее общего объема. Общее количество крови у птицы составляет 7,7% к весу тела. Ниже в качестве примера приведены сведения по допустимому взятию объема крови у отдельных представителей пернатых (табл.1).

Таблица 1

     
Допустимое прижизненное взятие объема крови у некоторых видов птиц

В тех случаях, когда допустимый объем взятия крови менее 4-5 мл, то ее пробы, как и у мелких млекопитающих, объединяют от нескольких особей одного вида и возраста из одного и того же места. Если необходимо индивидуальное исследование, птицу приходится умерщвлять и брать кровь в максимально возможном количестве.

У птиц среднего и крупного размера кровь прижизненно берут стерильным шприцем из подкрыльцовой вены, хорошо заметной на внутренней поверхности кистевого сгиба. Иглу вводят по ходу сосуда от сгиба крыла к туловищу.

У ослабленных крупных птиц и всех видов мелких взятие крови осуществляют из сердца. При этом результативно введение иглы сбоку у левого края грудины между ребрами, предварительно нащупав пульсирующее сердце. Нельзя вводить иглу близко к спине, т.к. возможен прокол легкого, обычно приводящий к гибели птицы. Все последующие манипуляции по получению сыворотки из цельной крови идентичны указанным выше для млекопитающих (разд.6.3.2).

От убитой птицы кровь для сыворотки можно взять только в первые 3-5 мин после отстрела. Поэтому необходима организация полевого рабочего места в непосредственной близости от пункта добычи. Для этого следует иметь походный "вирусологический чемодан" (укладку), где на одной стенке в штативах закреплено необходимое для работы, а откидывающаяся крышка служит столиком. После взятия крови птицу помещают в бязевый мешочек (для последующего сбора эктопаразитов) и в течение 2 ч доставляют к месту забора проб органов. Приемы взятия этого материала от птиц принципиально не отличаются от таковых при работе с млекопитающими.