МУК 4.2.1913-04 Методы количественного определения генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения в продуктах питания

5. Количественное определение рекомбинантной ДНК методом ПЦР
в режиме реального времени

Количественное определение рекомбинантной ДНК осуществляется методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием наборов реактивов, разрешенных к применению для этих целей в установленном порядке.

5.1. На примере метода, разработанного с использованием наборов TaqMan для анализа сои ("TaqMan GMO Soy Detection Kit") и кукурузы ("TaqMan GMO Maize Detection Kit").

5.1.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАБ (гексадецилтриметиламмониум бромид).

Приготовление растворов

- СТАБ-буфер.

В мерную колбу вносят 4 г СТАБ; 16,4 г NaCl; 3,15 г ТРИС - НСl; 1,5 г NаЭДТА, добавляют 100 мл деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см.

Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.

Перед использованием раствор выдерживают при комнатной температуре или подогревают в термостате при температуре 65 °С до полного растворения осадка. Непосредственно перед использованием в приготовленный лизирующий буфер вносят 2-меркаптоэтанол из расчета 4 мм на 1 см лизирующего буфера и перемешивают.

- СТАБ - осаждающий раствор.

В мерную колбу вносят 1 г СТАБ; 0,5 г NaCl, добавляют 100 см деионизированной воды, доводят рН раствора до 8,0 1 М NaOH, доводят объем деионизированной водой до 200 см.

Хранить при 4 °С не более 6 месяцев.

- 1,2 M NaCl.

Растворяют 7,0 г NaCl в 100 см деионизированной воды, перемешивают.

Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до 1 года.

Приготовленные растворы автоклавируют при 1 атм., 121 °С 15-20 мин или фильтруют через мембраны Millipore 0,4 мм.

- 70%-ный раствор этилового ректификованного спирта.

Смешивают 70 см 96%-ного этилового ректификованного спирта с 26 см деионизированной воды.

Хранить при температуре от 4 до 5 °С - не более 2 мес., в темной склянке.

Процедура выделения ДНК

- Навеску исследуемого гомогенизированного продукта массой 100 мг помещают в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф на 1,5 см.

- Добавляют 300 мм деионизированной воды, перемешивают шпателем.

- Добавляют 500 мм СТАБ-буфера с меркаптоэтанолом, тщательно перемешивают шпателем.

- Инкубируют при 65 °С 90 мин.

- Центрифугируют 10 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13000 об./мин.

- Переносят 500 мм супернатанта в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 см.

- Добавляют 500 мм хлороформа, перемешивают на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" 30 с.