МУК 4.2.1902-04 Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции

6.1. Метод выделения ДНК с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид)

Подготовка пробы (раствора ДНК).

- Навеску исследуемого продукта массой 70-80 мг поместить в микроцентрифужную пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

- Добавить 200 мкл - лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, тщательно растереть пробу в пробирке пестиком

- Добавить еще 600 мкл лизирующего буфера с меркаптоэтанолом, перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс".

- Инкубировать при 65 °С 40-60 мин, перемешать на аппарате для встряхивания, центрифугировать 7 мин на настольной микроцентрифуге типа Эппендорф при частоте вращения 13000 об/мин.

- Перенести супернатант в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл.

- Добавить 400 мкл хлороформа, предварительно насыщенного водой.

- Перемешать на аппарате для встряхивания типа "Вортекс" до образования суспензии.

- Центрифугировать 7 мин при частоте вращения 12000 об/мин.

- Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа. Экстракцию хлороформом повторить.

- Центрифугировать 7 мин при частоте вращения 12000 об/мин.

- Перенести верхнюю фракцию в чистую пробирку типа Эппендорф вместимостью 1,5 мл, не захватывая слой хлороформа.

- Добавить 600 мкл изопропилового спирта, взятого из морозильной камеры (минус 20 °С), перемешать.

- Поместить пробирку в морозильную камеру (минус 20 °С) на 30 мин, не менее. В морозильной камере можно оставить на ночь.

- Центрифугировать 6 мин при частоте вращения 12000 об/мин.

- Тщательно удалить верхний слой.

- Осадок промыть 200 мкл 70%-ного этилового спирта (2-3 раза), каждый раз перемешивая на аппарате для встряхивания типа "Вортекс", центрифугировать 6 мин при частоте вращения 12000 об/мин (суспендированный в 70%-ном этаноле образец можно оставить на ночь в морозильной камере при минус 20 °С).

- Последний раз тщательно до последней капли удалить спирт.

- Подсушить осадок 5 мин при 65 °С для удаления капель спирта.

- Растворить осадок в 50-100 мкл деионизированной воды, осторожно встряхивая.

- Полученный раствор ДНК готов для проведения ПЦР, хранить при минус 20 °С (допустимо неполное растворение осадка).