МУК 4.2.1902-04 Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции
7.3. Метод идентификации сои линии 40-3-2, устойчивой к глифосату [2]
Полимеразная цепная реакция проводится гнездовым методом с двумя раундами амплификации
Первый раунд. Оба раунда проводятся в течение одного рабочего дня.
Внешние праймеры:
1 - ССА CTG ACG ТАА GGG ATG ACG
2 - CAT GAA GGA CCG GTG GGA GAT
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл.5.
Таблица 5
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 188,7мкл | 377,5 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl | 25 мкл | 50 мкл |
3 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 12,5 мкл | 25 мкл |
4 | Праймер 1 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
5 | Праймер 2 (20 мкМ) | 6,25 мкл | 12,5 мкл |
6 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,3 мкл | 2,5 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Приготовленные реакционные смеси перемешать на вортексе и центрифугировать 30 с при 3000 об/мин.
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 48,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 48,0 мкл добавить 2,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об/мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл.6.
Таблица 6