МУК 4.2.1902-04 Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции
7.1. Метод идентификации промотора 35S [1]
Праймеры для идентификации промотора 35S:
1 - GCT ССТ АСА ААТ GCC АТС А
2 - GAT AGT GGG ATT GTG CGT CA
Реакционная смесь для проведения полимеразной цепной реакции, рассчитанная на 10 проб, представлена в табл.1.
Таблица 1
В пробирку типа Эппендорф вносятся на холоде следующие реактивы:
N пп | Реактивы | Объем реакционной смеси 25 мкл | Объем реакционной смеси 50 мкл |
1 | Деионизированная вода | 169 мкл | 338 мкл |
2 | Буфер для полимеразной цепной реакции с MgCl | 29 мкл | 58 мкл |
3 | Раствор БСА (20 мкг/мл) | 29 мкл | 58 мкл |
4 | Смесь нуклеотидов (4 млМ) | 14 мкл | 28 мкл |
5 | Праймер 1 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
6 | Праймер 2 (20 мкМ) | 7 мкл | 14 мкл |
7 | Taq-полимераза (5 ед./мкл) | 1,5 мкл | 3,0 мкл |
Примечание: реакционную смесь готовят на необходимое количество проб, но не меньше чем на 5.
Подготовка к проведению амплификации
- Реакционную смесь разлить в пробирки для проведения ПЦР по 24,5 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 25,0 мкл, или по 49,0 мкл в каждую, если объем реакционной смеси 50,0 мкл.
- В каждую пробирку с 24,5 мкл добавить 0,5 мкл раствора ДНК, в каждую пробирку с 49,0 мкл добавить 1,0 мкл раствора ДНК.
- Смесь перемешать, центрифугировать (30 с при 3000 об/мин).
- При использовании амплификатора с крышкой без подогрева в каждую пробирку добавить каплю минерального масла.
Условия амплификации представлены в табл.2.
Таблица 2
Стадия | Тип амплификатора* | |
Gene Amp 2700; Био-Рад; Терцик МС-2, АМПЛИ-4 | Trio | |
Денатурация | 3 мин/94 °С | 3 мин/94 °С |
20 с/94 °С | 30 с/95 °С | |
Амплификация | 40 с/54 °С | 40 с/54 °С |
60 с/72 °С | 40 с/72 °С | |
Количество циклов амплификации | 40 | 40 |
Конечное удлинение | 3 мин/72 °С | 3 мин/72 °С |
Фаза остывания | 1 мин/4 °С | 1 мин/4 °С |
Скорость нагрева | 0,77 °С/с | 1 °С/с |
Скорость остывания | 3,15 °С/с | 1 °С/с |
* В табл.2 указаны типы амплификаторов, на которых проводились испытания. Для других амплификаторов необходимо подбирать условия проведения амплификации индивидуально. | ||
После проведения амплификации пробы готовы для проведения электрофореза в агарозном геле. Схема проведения электрофореза п.8.
Продукт амплификации - 195 пар нуклеотидов, прилож.1.