МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ УСТОЙЧИВОСТИ КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ, КОНТАМИНИРУЮЩИХ ИЗДЕЛИЯ МЕДИЦИНСКОГО НАЗНАЧЕНИЯ В УСЛОВИЯХ ПРОИЗВОДСТВА И ЭКСПЛУАТАЦИИ, К СТЕРИЛИЗУЮЩИМ АГЕНТАМ

1. Общие положения

1.1. Методические указания предназначены для бактериологических лабораторий учреждений, занимающихся разработкой методов, способов и средств стерилизации изделий медицинского назначения, а также осуществляющих контроль эффективности стерилизации, и для бактериологических лабораторий предприятий, выпускающих стерильную продукцию.

1.2. Методические указания разработаны с целью унификации методов определения устойчивости микроорганизмов, выделяемых с изделий медицинского назначения, к различным средствам стерилизации:

водяному насыщенному пару при избыточном давлении, сухому горячему воздуху, смеси ОБ, чистой окиси этилена, растворам химических препаратов (перекись водорода, дезоксон и др.), ионизирующему излучению (гамма-излучение).

1.3. По имеющимся данным, к перечисленным стерилизующим средствам, за исключением гамма-излучения, наиболее устойчивыми являются споры микроорганизмов, в связи с чем оценивают устойчивость к ним спор контаминатов, к гамма-излучению - как спор, так и неспорообразующих кокков.

2. Выделение культур микроорганизмов с изделий медицинского назначения и с окружающих предметов

2.1. С изделий, подвергаемых стерилизации паровым, воздушным, газовым методом и методом погружения в растворы химических препаратов, выделяют только спорообразующие микроорганизмы, с изделий, стерилизуемых ионизирующим излучением, - как спорообразующие, так и неспорообразующие (кокки).

2.2. Выделение культур с изделий в лечебно-профилактических учреждениях проводят в местах их обработки и эксплуатации: непосредственно в операционных, перевязочных, процедурных и др. кабинетах, на промышленных предприятиях - на участках технологического процесса.

2.3. Отбор проб с целью выделения культур микроорганизмов с изделий, поверхностей помещений, оборудования и кожи рук, проводят методом отпечатков и смыва, одежды персонала - методом отпечатков, из воздуха - седиментационным и аспирационным методами.

2.4. Забор проб методом смыва проводят стерильной марлевой салфеткой размером 5x5 см, смоченной стерильной водопроводной водой или стерильным физиологическим раствором из расчета 2 мл раствора на 10 салфеток; тщательно протирают всю поверхность изделия, обращая особое внимание на труднодоступные места, участки поверхностей помещений, оборудования, затем марлевую салфетку отмывают в 10 мл стерильного физиологического раствора (водопроводная вода) с бусами в течение 10 минут и отмывную жидкость засевают по 0,2 мл на поверхность казеинового агара в 2 чашки Петри, инкубируют посевы при температуре 32 °С 48 часов. При росте на чашках споровых культур, а также кокков при оценке устойчивости к ионизирующему излучению каждую исследуемую колонию отдельно пересевают на поверхность питательной среды (методом штриха), выросшие колонии микроскопируют. При получении чистой спорообразующей культуры ее пересевают на косой пшеничный агар, выдерживают 48 часов при температуре 37 °С и 5 суток в условиях бокса в темноте при комнатной температуре, после чего проводят исследование устойчивости, а культуру кокков пересевают на скошенный казеиновый агар, инкубируют при температуре 37 °С в течение 24 часов.

2.5. При заборе проб методом отпечатков используют бакпечатки или предметные стекла - пластины. Для приготовления пластин предметное стекло, разрезанное пополам, помещают в стерильные чашки Петри. Растопленную питательную среду пипеткой, приоткрыв чашку Петри, наливают по 1,5-2,0 мл на поверхность каждого стекла до его полного покрытия. Бакпечатки заливают питательными средами. Срок хранения приготовленных пластин и бакпечаток при температуре +4 °С - 3 суток. Отпечаток на питательную среду производят путем прикладывания предметного стекла со средой (бакпечатки) к исследуемой поверхности на 2-3 секунды. После чего пластины средой кверху помещают в ту же чашку Петри, а бакпечатки вставляют в тот же стакан. Инкубация посевов при заборе проб с кожи рук - при температуре 37 °С в течение 48 часов.

При выделении микроорганизмов с одежды отпечатки берут со следующих участков: нижняя часть рукава, верхняя, средняя и нижняя часть передней поверхности халатов, комбинезонов, а также с шапочек, косынок.

Инкубацию посевов при заборе проб с кожи рук осуществляют при температуре 37 °С в течение 48 часов.

Инкубацию посевов с изделий и поверхностей окружающих предметов - при температуре 32 °С в течение двух суток.

2.6. При седиментационном методе отбора проб воздуха чашки Петри с питательной средой устанавливают в помещении на уровне рабочего стола на 15-30 минут, затем их закрывают крышками и переносят в термостат. При аспирационном методе забор проб проводят на чашки Петри с питательной средой аппаратом Кротова или на мембранные фильтры, которые затем помещают в чашки Петри на поверхность питательного агара. Инкубация посевов при температуре 32 °С - 48 часов.

2.7. Споровую культуру хранят на косячках пшеничного агара, пересевают 1 раз в 6 недель, культуру кокков - на косячках казеинового агара, пересевают 1 раз в 4 недели. При длительном хранении культуры пересевают на вышеуказанные среды методом укола и заливают стерильным вазелиновым маслом или хранят в лиофильно высушенном состоянии в ампулах.

3. Приготовление взвеси культуры микроорганизмов

3.1. Суточную бульонную культуру отобранного штамма засевают на поверхность казеинового агара при культивировании неспорообразующих микроорганизмов и инкубируют их при 37 °С - 24 часа; спорообразующие бактерии инокулируют на поверхность пшеничного агара, инкубируют при температуре 37 °С - 48 часов и 5 суток при комнатной температуре в темноте. По истечении указанного срока проверяют интенсивность спорообразования культуры. Для приготовления мазка культуру забирают петлей с верхнего, среднего и нижнего участка агара, все три пробы растирают вместе на одном предметном стекле, распределяя тонким слоем. Мазок окрашивают фуксином. Под микроскопом исследуют не менее 10 полей зрения, количество спор в поле зрения должно быть не менее 90%.

3.2. Для приготовления взвеси культуру с агара снимают бактериологической петлей и растирают о стенки пробирки со стерильным физиологическим раствором, полученную взвесь фильтруют через ватно-марлевый фильтр и доводят по оптическому стандарту мутности до содержания 2x10 микробных клеток в 1 мл.