Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище

5. Определение содержания нерастворимых и растворимых пищевых волокон
(ферментативный метод)

Сущность метода заключается в гидролизе и удалении белковых и крахмалистых веществ ферментами, аналогичными ферментам пищеварительного тракта человека из БАД на растительной основе. Метод позволяет определять растворимые (в этиловом спирте) и нерастворимые пищевые волокна, отличающиеся физиологическим действием.

Специфическая аппаратура, материалы, реактивы

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания 200 г второго класса точности по ГОСТ 24104-80.

Шкаф сушильный лабораторный.

Спектрофотометр СФ-26 или другой с аналогичными характеристиками.

Водяная баня любого типа, обеспечивающая температуру нагрева 37±0,2°С, 40+0,2 °С, 60±0,2 °С, 100 °С, или термостат.

Прибор для определения рН среды с диапазоном измерений 0-14 с погрешностью измерения ±0,1 ед. рН.

Воронки стеклянные с пористым фильтром N 40, N 100 по ГОСТ 25336-82.

Спирт этиловый по ГОСТ 5962-67 или ГОСТ 18300-72 и раствор с массовой долей этилового спирта 700 г/дм.

Панкреатин, фармзавод Лейрас, А/О Хухтамяки, медицинский препарат, активность которого гарантирована в пределах установленных сроков хранения.

Глюкоамилаза очищенная по ТУ 64-13-18-88.

Гемоглобин бычий окисленный лиофилизированный МБ по ТУ 6-09-10-656-77.

Протеаза N Р-3910, Sigma Chemical Co. (хранится только в холодильнике) или другой протеолитический ферментный препарат аналогичной активности, например пепсин А из слизистой оболочки желудка свиньи, активность которого устанавливают следующим образом. Сначала готовят 2%-ный раствор гемоглобина. Для этого 300 мг гемоглобина растворяют в 12,9 см дистиллированной воды (до полного растворения), приливают 2,1 см раствора соляной кислоты концентрации 0,3М.

Определение активности проводят следующим образом: 68,5 мг пепсина растворяют в 10 см раствора соляной кислоты концентрации 0,03М; 0,2 см полученного раствора пепсина приливают к 1 см субстрата гемоглобина, предварительно нагретого на водяной бане в течение 5 мин при температуре 37 °С. Инкубируют смесь при той же температуре в течение 10 мин (по секундомеру). Реакцию останавливают путем приливания 5 см раствора соляной кислоты концентрации 100 г/дм. Смесь выдерживают на водяной бане еще 5 мин. Фильтруют через плотный бумажный фильтр (фильтраты должны быть абсолютно прозрачными). Одновременно с опытными готовят контрольную пробу. Для этого к 1 см субстрата гемоглобина приливают 0,2 см раствора соляной кислоты концентрации 0,03М и 5 см 10% раствора трихлоруксусной кислоты, затем инкубируют смесь и фильтруют по предложенной выше схеме. Содержание пепсина определяют спектрофотометрически: оптическую плотность опытных и контрольных фильтратов измеряют против дистиллированной воды при длине волны 280 нм в кюветах 1 см на СФ-26 или другом с подобными характеристиками.

Построение калибровочного графика: готовят ряд растворителей рабочего стандарта пепсина с концентрацией фермента 50, 100, 150, 200, 250 мкг/см. Для этого пользуются следующими данными, приведенными в табл.9.

Таблица 9

     
Количество ферментов

Во всех растворах, приготовленных по таблице, определяют содержание пепсина, как описано выше, и строят график, откладывая на оси ординат величины оптической плотности, а на оси абсцисс - концентрацию пепсина в мкг. По калибровочному графику определяют количество активного пепсина в исследуемом препарате. Результаты измерений выражают в протеиназных единицах (по гемоглобину), ПЕ. За протеиназную единицу принимают действие такого количества фермента, которое в данных условиях опыта и измерений за 1 мин приводит к увеличению оптической плотности фильтрата на единицу. Например, по предложенному калибровочному графику 250 мкг пепсина увеличивают оптическую плотность фильтрата на 0,5 за 10 мин, следовательно, 5000 мкг пепсина приводит к увеличению оптической плотности на единицу за 1 мин (1 ПЕ=5000 мкг или 1 мкг=5х10 ПЕ).     

Подготовка к испытанию

Приготовление фосфатного буферного раствора панкреатина

Готовят 0,05М фосфатный буфер рН 6,0 (0,875 г дигидрофосфата и 6,05 г натрия гидрофосфата растворяют в примерно 700 см дистиллированной воды в колбе на 1 дм, затем доводят до метки дистиллированной водой).

Готовят раствор панкреатина с концентрацией панкреатина в 0,05М фосфатном буфере 5 мг/см.     

Приготовление 0,5%-ного водного раствора глюкоамилазы