Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище

4. Флуориметрический метод определения рибофлавина (витамин В2)
титрованием рибофлавинсвязывающим апобелком

Принцип метода основан на способности рибофлавинсвязывающего апобелка при связывании с рибофлавином полностью тушить его флуоресценцию.     

Реактивы и их приготовление

0,1 н. соляная кислота (НСl).

К дистиллированной воде добавляют 0,8 см концентрированной (=1,19 г/см) соляной кислоты по ГОСТ 3118-77, объем доводят до 100 см.

Стандартный раствор рибофлавина () концентрацией 100 мкг/см.

5 мг рибофлавина растворяют при нагревании на водяной бане при 70 °С в 45 см 0,1 н. соляной кислоты (раствор 1). После охлаждения объем доводят до 50 см. Концентрацию рибофлавина уточняют спектрофотометрически по коэффициенту молярной экстинкции (прилож.3). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 6 мес.

Рабочий стандартный раствор (концентрация рибофлавина 2 мкг/см).

Перед определением к 1 см стандартного раствора добавляют дистиллированную воду в мерной колбе до объема 50 см.

4М фосфат калия однозамещенный ().

54,4 г растворяют в дистиллированной воде, объем доводят до 100 см.

Рибофлавинсвязывающий апобелок (РбСБ) со связывающей способностью 5-15 мкг рибофлавина на 1 мг белка.

Можно использовать коммерческий препарат (Sigma, США, R 8628) или выделить его из белка куриного яйца по методу, изложенному в прилож.3.     

Средства измерений

Спектрофлуориметр F-2000 (Hitachi, Япония) или аналогичный по оптическим характеристикам.     

Условия измерения

Интенсивность флуоресценции измеряют в кварцевой кювете объемом 3 см с длиной оптического пути 1 см при длине волны возбуждающего света =465 нм, испускаемого =525 нм.     

Приготовление кислотного гидролизата

3 таблетки (драже) или содержимое 3 капсул растирают и тщательно перемешивают в ступке. При расчете массы навески исходят из того, чтобы в 1 см гидролизата содержалось не более 5 мкг рибофлавина. К навеске (100-500 мг в зависимости от содержания витамина) добавляют 100 см 0,1 н. НСl и помещают на кипящую водяную баню на 40 мин. Затем пробы охлаждают до комнатной температуры, доводят объем дистиллированной водой до 100 см и при необходимости фильтруют.

В случае необходимости разводят гидролизат до концентрации рибофлавина около 0,5 мкг/см или уменьшают количество гидролизата, взятого на анализ, с таким расчетом, чтобы интенсивность флуоресценции опытной пробы (о-к) была сопоставима с интенсивностью флуоресценции добавленного в пробу стандарта (с-о).     

Ход определения

К 0,1 см кислотного гидролизата добавляют равный объем 4М и дистиллированную воду до 3 см, измеряют флуоресценцию (о), добавляют 0,03 см стандартного раствора рибофлавина концентрацией 2 мкг/см. После перемешивания повторяют измерение (с). Затем добавляют по 0,03 см раствора РбСБ, перемешивают, измеряют флуоресценцию после каждой добавки белка. Добавление белка продолжают до тех пор, пока флуоресценция после двух добавок перестает снижаться (к). Разница интенсивности флуоресценции (о-к) пропорциональна количеству рибофлавина в гидролизате. Необходимое количество РбСБ подбирают эмпирически.     

Обработка результатов