Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище

3. Одновременное определение витаминов в-1 и в-2 в бад методом
высокоэффективной жидкостной хроматографии

     
Сущность метода

Витамин В-1 (тиамин) под действием красной кровяной соли превращается в тиохром, который флуоресцирует в щелочной среде. В данном варианте методики происходит постколоночная дериватизация, то есть после отделения тиамина от пробы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращеннофазовом ионпарном варианте в изократическом режиме, а окисляющий агент смешивается с выходящим из колонки элюатом, и образующийся тиохром детектируется флуориметрическим методом [1] при соответствующих длинах волн. Массовую концентрацию рибофлавина определяют по площади (высоте) пика при соответствущих ему длинах волн, так как это соединение способно флуоресцировать в нативном состоянии в растворе.

Характеристика погрешности измерений

Настоящая методика измерений массовой концентрации пиридоксина в биологически активных добавках с вероятностью 0,95 обеспечивает выполнение анализа с погрешностями ±15% во всем диапазоне измерений.     

Описание хроматографической системы

Система для ВЭЖХ со спектрофлуориметрическим детектором с монохроматорами на линии возбуждения и эмиссии (или набором соответствующих фильтров в интервале длин волн от 220-650 нм), двухходовым смесителем, в котором происходит реакция образования тиохрома из витамина В-1; и аналитической хроматографической колонкой из нержавеющей стали, длиной 150 мм и 250 мм, внутренним диаметром 4 мм и 4,6 мм, с обращеннофазовым сорбентом типа Нуклеосил 100 С18, зернением 5 мкм или другим сорбентом, аналогичным по свойствам, с эффективностью по тиамину и рибофлавину не ниже 8000 теоретических тарелок.     

Подготовка к выполнению измерений

     
Условие выполнения измерений и подготовки проб

Для предотвращения разрушения рибофлавина и тиамина под действием света подготовку проб и приготовление их стандартных растворов, а также растворов гексацианоферрата (III) калия проводят в посуде темного стекла, либо обернув колбочки темной бумагой.     

Приготовление растворов

     
Приготовление раствора соляной кислоты с молярной концентрацией 0,1М.

К дистиллированной воде добавляют 4 см концентрированной соляной кислоты (=1,19 г/см), объем доводят до 500 см.

Экстрагирующая смесь для гидролиза капсул с содержимым на жировой основе

40 г винной кислоты растворяют в 800 см дистиллированной воды, добавляют 1 г Твина-80, объем доводят до 1000 см.

3,75М раствор гидроксида натрия: К 75 г гидроксида натрия добавить 500 см дистиллированной воды.

0,04М раствор гексаноцианоферрата (III) калия: 1,0 г гексаноцианоферрата (III) калия растворить в воде в мерной колбе вместимостью 100 см и довести дистиллированной водой до метки.

1,6 10М щелочной раствор гексаноцианоферрата (III) калия

2,0 см раствора с содержанием гексаноцианоферрата (III) калия 10 г/1000 мл смешать в мерной колбе вместимостью 50 см с 3,75М раствором гидроксида натрия и довести до метки этим же раствором.     

Подвижная фаза для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 500 см добавляют примерно 50 см дистиллированной воды, 60 см метанола, 100 мг гептилсульфоната натрия, 10 см ледяной уксусной кислоты и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают и дегазируют на УЗ-бане в течение 10 мин.     

Количественное определение витаминов В-1 и В-2