Метод основан на колориметрической реакции стеринов, извлекаемых диэтиловым эфиром из омыленных проб растительных масел, с уксусным ангидридом в присутствии концентрированной серной кислоты.
Условия проведения анализа
Экстракцию неомыленных веществ следует проводить по возможности быстро, предохраняя пробы от попадания на них прямого солнечного света.
Отгонку диэтилового эфира из проб следует проводить под вакуумом водоструйного насоса при комнатной температуре.
Подготовка к проведению анализа
Приготовление и очистка реактивов
Безводный сернокислый натрий прокаливают в течение 1-1,5 ч при температуре 110 °С. Диэтиловый эфир обрабатывают марганцовокислым калием (5 г на л) и гидратом окиси калия (10 г на 1 дм
) в течение суток, а затем перегоняют. Этиловый спирт ректификованный технический освобождают от альдегидов. Начальную и конечную порции отгона отбрасывают. Хлороформ сушат в течение суток под хлористым кальцием и перегоняют.
Построение градуировочного графика
Градуировочный график строят на основании результатов анализа проб с известным содержанием чистого 
-ситостерина.
В мерную колбу вместимостью 100 см отвешивают 0,15-0,20 г -ситостерина (с записью результата до 4-го знака после запятой). Навеску растворяют в 100 см хлороформа. Из полученного раствора готовят серию стандартных растворов с содержанием -ситостерина 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18; 0,20 г/дм. Из каждого раствора отбирают пипеткой 3 см, добавляют 2 см уксусного ангидрида и 6 капель серной кислоты. Через 10 мин после добавления кислоты измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм. В качестве контроля служит раствор, состоящий из 3 см хлороформа, 2 см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.
Градуировочный график строят в координатах: оптическая плотность (D) - концентрация стандартных растворов -ситостерина. Градуировочный график строят для каждого спектрофотометра и проверяют при смене партий путем определения оптической плотности стандартных растворов двух разных концентраций.
Проведение анализа
Испытуемый образец (1-3 г) взвешивают в колбе вместимостью 100 см (с записью результата взвешивания до 4-го знака после запятой), добавляют 0,1-0,3 г аскорбиновой кислоты и 10-30 см свежеприготовленного 2 н. спиртового раствора КОН. Смесь нагревают с обратным холодильником на кипящей водяной бане в течение 30 мин.
Содержимое колбы охлаждают и количественно переносят в делительную воронку с 30-90 см дистиллированной воды. Неомыляемые вещества экстрагируют диэтиловым эфиром 3-4 раза порциями по 20-60 см. Объединенный эфирный экстракт промывают в делительной воронке дистиллированной водой до нейтральной реакции промывной воды по фенолфталеину. Промытую эфирную вытяжку помещают в коническую колбу, засыпают 5-10 г безводного сульфата натрия и оставляют в темном месте на 30 мин, периодически взбалтывая. Затем содержимое колбы фильтруют через бумажный фильтр в другую колбу, фильтр ополаскивают эфиром. Эфир отгоняют под вакуумом при температуре не выше 25-30 °С.
Остаток в колбе после отгонки эфира растворяют в зависимости от навески исследуемого образца в 1-3 см бензола. Затем производят разделение компонентов смеси неомыляемых веществ методом тонкослойной хроматографии. Для этого на пластинку "Силуфол" наносят 50-150 мкл бензольного раствора неомыляемых веществ в виде полоски, отстоящей на 2 см от нижнего и боковых краев пластинки.
На одном уровне с пробой на расстоянии 1 см от краев пластинки наносят по капле раствор -ситостерина. Пластинку помещают вертикально в хроматографическую камеру, в которую заранее наливают смесь диэтилового и петролейного эфиров, взятых в соотношении 1:1. Количество растворителя зависит от размеров хроматографической камеры и регулируется высотой его слоя, равной 1 см.
Развитие хроматограммы продолжается до тех пор, пока фронт растворителя не поднимается на 10-12 см. Обычно это занимает 10-12 мин. Затем пластинку вынимают из камеры и подсушивают на воздухе до исчезновения запаха эфира. Края хроматограммы шириной 2 см опрыскивают 5%-ным спиртовым раствором фосфорно-молибденовой кислоты, после чего пластинки помещают на 1-5 мин (до проявления) в термостат с температурой около 90 °С. На уровне окрашенного пятна свидетеля соскребают слой адсорбента. Адсорбент элюируют хлороформом 6-8 раз порциями по 1 см. После каждого элюирования адсорбент отделяют центрифугированием или фильтрацией. Объединенный элюат собирают в градуированную пробирку и упаривают до объема 3 см. К хлороформному раствору стеролов приливают 2 см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты (по капле). Через 10 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при 690 нм.
Контролем служит раствор, состоящий из 3 см хлороформа, 2 см уксусного ангидрида и 6 капель концентрированной серной кислоты.
Обработка результатов
Массовую долю стеринов в пробе (
, %) рассчитывают по формуле:
, где
- объем хлороформного раствора, взятого для проведения колориметрической реакции, см;
- объем бензольного раствора неомыляемых веществ, см;
