Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище

2.2. Определение состава углеводов с помощью метода ВЭЖХ

Настоящий метод основан на выделении, разделении и количественном определении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии моно-, ди-, олигосахаров, а также сахарных спиртов. Он распространяется на определение глюкозы, фруктозы, арабинозы, фукозы, галактозы, ксилозы, лактозы, лактулозы, мальтозы, мальтотриозы, маннозы, сахарозы, раффинозы, стахиозы, сорбита, инозита, мальтита, ксилита, изомальта, лактитола, добавленных в БАД.     

Приборы и реактивы

Прибор для проведения хроматографии методом ВЭЖХ, состоящий из насоса, детектора-рефрактометра, колонки 250 мм х4 мм, Сепарон SGX или аналогичная.

Компьютер с программным обеспечением по приему и обработке хроматографических данных.

Ротационный испаритель, водяная баня, обратный холодильник, две стеклянные колонки 7-10 см (внутренний диаметр 10 мм).

Ацетонитрил для хроматографии.

Этиловый спирт 80%.

Ионообменная смола Дауэкс 50х4, 200-400 меш (Н-форма).

Ионообменная смола Дауэкс 1х8, 200-400 меш (формиатная форма).

2Н NaOH, 3Н HCI, 3Н формиат натрия, бидистиллированная вода.

0,1%-ный раствор азотнокислого серебра.

Изопропиловый спирт.

Экстракция

Углеводы извлекают из БАД 80% этиловым спиртом с учетом естественной влаги. Навеску БАД заливают в колбе в соотношении 1:4 по сухим веществам 96% этанолом и необходимым количеством воды с расчетом, чтобы общая концентрация спирта была в пределах 80-82%. Колбу нагревают с обратным холодильником на водяной бане при 70-80 °С в течение 15 мин. Затем спиртовую вытяжку отфильтровывают. К остатку приливают опять раствор 80%-ного спирта и экстракцию повторяют в тех же условиях. Всего углеводы экстрагируют из продукта 3-4 раза.

Спиртовые экстракты объединяют, спирт отгоняют на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °С.     

Очистка экстракта

Предназначенные для определения экстракты нейтральных сахаров содержат также вещества, имеющие заряд (аминокислоты, пептиды и др.) Чтобы освободить нейтральные сахара от этих примесей, экстракты пропускают через колонки с дауэксом 50х4, непосредственно соединенную с колонкой, содержащей дауэкс 1х8.

Подготовка дауэкс 50х4, 200-400 меш.

Смолу последовательно промывают на бюхнеровской воронке большими объемами 2н NaOH, дистиллированной водой, 3н HCI и опять водой. Избыток воды удаляют путем длительного отсасывания насосом. Готовят суспензию смолы в дистиллированной воде (1:1) и используют ее для заполнения колонки.

Ионнообменная способность для дауэкса 50х4 в сухом виде составляет 5,1 мэкв/см и во влажном 1,7 мэкв/см соответственно.     

Подготовка дауэкс 1х8, 200-400 меш.

Для работы нужна формиатная форма смолы. Последнюю готовят из дауэкса 1х8 (СГ-форма), пропуская через смолу на бюхнеровской воронке 3н формиат натрия до тех пор, пока проба на СГ не станет отрицательной (проба с азотнокислым серебром). После этого смолу промывают большими объемами дистиллированной воды и заполняют колонку. Ионнообменная способность для дауэкса 1х8 в сухом виде составляет 3,2 мэкв/см и во влажном виде 1,4 мэкв/см.

С двух колонок собирают элюент и, если необходимо, его концентрируют в роторном испарителе. Чтобы упарить воду и не поднимать температуру, к образцу добавляют этанол. Упаренный образец переносят в мерную посуду и замеряют объем и хроматографируют.