Р 4.1.1672-03 Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище

2. Определение аминокислотного состава

Сущность метода заключается в гидролизе образца до аминокислот и последующем количественном определении образовавшихся аминокислот на аминокислотном анализаторе.

Подготовка к испытанию

В пробе определяют общий белок, содержание липидов и влажность по методикам, описанным в настоящем руководстве.

Для жидких БАД учитывают содержащуюся воду в процессе приготовления гидролизующей смеси таким образом, чтобы концентрация соляной кислоты была 6М. При содержании липидов более 5% проводят обезжиривание способом, указанным в табл.1. После обезжиривания остаток подсушивают на воздухе и определяют содержание общего белка. Рассчитывают величину навески образца для гидролиза, исходя из соотношения белка к кислоте, представленных в табл.1, и при условии содержания белка в пробе не менее 5 мг.

Таблица 1

     
Условия подготовки проб к анализу для БАД, содержащих различные уровни липидов

     

Проведение испытания

Три навески БАД или обезжиренного остатка, подготовленных к гидролизу в соответствии с разделом 1, взятых с точностью 0,0001 г, помещают в стеклянную ампулу с оттянутым концом, заливают расчетным количеством соляной кислоты (в случае жидких БАД берут расчетное количество концентрированной кислоты и доводят до концентрации 6М).

Ампулы запаивают, устанавливают в строго вертикальном положении в металлический патрон или фарфоровый стакан с парафином и помещают в сушильный шкаф с заранее отрегулированной температурой 110±2 °С. Нагревание проводят непрерывно в течение 24, 48 и 72 ч. Затем ампулы охлаждают до комнатной температуры. Необходимость трех временных отрезков гидролиза объясняется различиями в скорости отщепления отдельных аминокислот. На основании результатов последующих анализов содержания аминокислот за каждое время гидролиза строят кривую и методом интерполяции или экстраполяции до нулевого времени находят максимальную величину.

Каждую ампулу вскрывают и сразу приступают к удалению соляной кислоты. Если в гидролизате образовался видимый осадок, его удаляют центрифугированием или фильтрованием с последующим доведением фильтрата в мерной колбе до 25 см до точного объема. В случае конечного объема больше 5 см и при использовании высокочувствительных приборов для удаления соляной кислоты берут аликвоту.

Удаление соляной кислоты проводят одним из следующих способов:

а) помещают ампулу или пробирку в вакуум-эксикатор над гранулированным гидратом окиси натрия (NaOH) на 12-18 ч;

б) на роторном испарителе при температуре не выше 60 °С. Для этого гидролизат количественно переносят в грушевидную колбу, ополаскивая ампулу дистиллированной водой.

Остаток переносят количественно в мерную колбу с помощью нитратного буфера рН 2,2 или раствора соляной кислоты 0,02 М и доводят до метки. Полученный раствор гидролизата подвергают анализу на аминокислотном анализаторе в соответствии с инструкцией прибору.

В случае, если анализ не может быть проведен немедленно, осадок освобождают от следов соляной кислоты путем добавления к нему дистиллированной воды и повторного испарения на роторном испарителе или в вакуумном эксикаторе. Операцию повторяют до полного исчезновения запаха соляной кислоты.

Хранят образец в морозильной камере или нижней камере холодильника при температуре не выше 5 °С, перед анализом разводят цитратным буфером до необходимой концентрации. Обнаруженный осадок отфильтровывают через плотный фильтр.

Метрологические характеристики

Относительное допустимое расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных в одной лаборатории, по отношению к среднему арифметическому значению (Rr) и относительное допустимое расхождение между результатами испытания, выполненных в двух разных лабораториях, по отношению к среднему арифметическому значению (RR) для основных аминокислот при концентрациях, характерных для трех важнейших групп продуктов, приведены в табл.2.

Таблица 2

     
Допустимые относительные внутрилабораторные (Rr) и межлабораторные (RR) расхождения
результатов определения содержания аминокислот в основных группах БАД