МУК 4.2.801-99 Методы микробиологического контроля парфюмерно-косметической продукции

4.3. Выявление и идентификация бактерий сем. Enterobacteriaceae

К семейству Enterobacteriaceae относятся грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты.

4.3.1. Сущность метода

Метод основан на выявлении бактерий семейства Enterobacteriaceae с использованием накопительных и селективных питательных сред с дальнейшей идентификацией выявленных бактерий по нижеследующим биохимическим тестам.

4.3.2. Проведение испытания

10 см исследуемого материала из разведения 10, приготовленного по п.3.2.1.3, вносят в стеклянный флакон вместимостью 200 см, содержащий 100 см одной из питательных сред по п.6.4.9. Смесь перемешивают и инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24-48±3) ч.

При наличии признаков роста на средах накопления (помутнение среды, изменение ее цвета) делают пересев петлей на чашки Петри со средой Эндо (п.6.4.10.1). Посевы инкубируют при температуре (37±1) °С в течение (24-48±3) ч.

На среде Эндо бактерии семейства Enterobacteriaceae образуют колонии круглые, малиновые с металлическим блеском или без него, розовые, бесцветные, блестящие, выпуклые, диаметром 1-4 мм.

При окраске по Граму наблюдаются грамотрицательные неспорообразующие палочки.

При отсутствии роста на среде Эндо типичных для семейства Enterobacteriaceae колоний считают, что в образце нет представителей данного семейства.

Колонии, подозрительные по морфологии (каждую отдельно), пересевают петлей на одну из скошенных сред по п.6.4.7. Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение (24±3) ч. Культуры проверяют на чистоту.

Чистые культуры исследуют на наличие фермента цитохромоксидазы, для чего полоску фильтровальной бумаги смачивают реактивом на обнаружение цитохромоксидазы (п.6.4.6) и наносят бактериологической петлей или стеклянной палочкой суточную чистую культуру исследуемых бактерий. Синее окрашивание, появляющееся через 2-5 мин, свидетельствует о положительной оксидазной реакции.

При отрицательной оксидазной реакции культуры пересевают петлей на среду для определения ферментации глюкозы по п.6.4.10.2 (допускается использование О/F-теста) и в среду для определения способности восстанавливать нитраты в нитриты по п.6.4.10.3.

В половину пробирок со средой для определения ферментации глюкозы вносят по 0,5 см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение (24±3) ч. При наличии роста ферментацию глюкозы устанавливают по изменению цвета среды из красного в желтый в пробирках с маслом и без него.

При проведении О/F-теста посев производят уколом в два столбика со средой Хью-Лейфсена по п.6.4.10.4, один из которых заливают 1 см стерильного вазелинового масла. Посевы инкубируют при (37±1) °С в течение (24±3) ч. При положительной реакции происходит изменение цвета среды при культивировании как в аэробных, так и в анаэробных условиях.

О наличии нитритов в среде судят по появлению красного окрашивания при внесении в среду реактива Грисса (п.6.4.5). Для чего к суточной исследуемой культуре на среде для определения наличия нитритов приливают 0,2-0,3 см реактива Грисса, погружая пипетку до дна пробирки. Появление красного окрашивания свидетельствует о наличии нитритов.

4.3.3. Обработка результатов

Если в исследуемом образце обнаружены грамотрицательные неспорообразующие палочки, которые дают отрицательную оксидазную реакцию, ферментируют глюкозу с образованием кислоты и восстанавливают нитраты в нитриты, это значит, что парфюмерно-косметическое средство контаминировано бактериями сем. Enterobacteriaceae.