МУК 3.2.987-00

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

Паразитологическая диагностика малярии

     

Дата введения 2001-01-01

1. Методические указания подготовлены сотрудниками Института медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского Московской медицинской Академии им. И.М.Сеченова Минздрава России (к.м.н. Рабинович С.А., к.б.н. Кукина И.В., Mа.....ская* Е.В., к.м.н. Морозов Е.Н.) и Федерального центра государственного санитарно-эпидемиологического надзора Минздрава России (к.б.н. Цыбина Т.Н., Сыскова Т.Г.).

________________

* Брак оригинала. - Примечание изготовителя базы данных.     

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 19 октября 2000 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения и нормативные ссылки

Паразитологическую лабораторную диагностику малярии проводят клинико-диагностические лаборатории лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ) системы Минздрава, ведомственных учреждений, а также другие лаборатории, независимо от принадлежности и форм собственности (НИИ, вузов, Минобороны, УВД, частных клиник и т.д.), имеющие лицензию и аккредитованные в системе госстандарта и госсанэпиднадзора в установленном порядке.

Органы и учреждения государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации организуют и проводят эпидемиологический надзор за малярией, частью которого является:

контроль за уровнем лабораторной диагностики малярии в клинико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений и других ведомств (в т.ч. исследования: 1) контрольные - не менее 10% препаратов крови, от числа отрицательных; 2) обязательные - 100% сомнительных и положительных препаратов крови с целью подтверждения лабораторного диагноза малярии);

обследование населения в очагах малярии, обследование населения по эпидпоказаниям и с консультативной целью.

В настоящих методических указаниях использованы ссылки на следующие нормативно-методические и правовые документы.

Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" (30 марта 1999, N 52-ФЗ).

"Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" (22 июля 1993, N 5487-1).

Санитарные правила и нормы 3.2.569-96* "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

_______________

* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. - Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 3.1/3.2.558-96* "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний".

_______________

* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. - Примечание изготовителя базы данных.

Санитарные правила 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами 3-4 групп патогенности и гельминтами".

2. Общие положения

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных и местных случаев заболевания требуют своевременной лабораторной диагностики, необходимой для адекватного лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Малярию человека вызывают 4 вида паразитических простейших рода Plasmodium: Р. falciparum - возбудитель тропической малярии, Р. vivax - трехдневной малярии, Р. ovale - малярии типа трехдневной, Р. malariae - четырехдневной малярии. Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера: географический анамнез (пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера: лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки и ряд других - обязывают врачей лечебно-профилактических учреждений заподозрить малярию.

Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

3. Характеристика развития малярийного паразита в эритроцитах

Проявления малярии обусловлены развитием паразита в эритроците - так называемой эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии образуются бесполые и половые формы паразита.

Бесполые формы за период времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития, строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные свойства) хорошо различимы в "тонком мазке" крови. Трофозоиты - одноядерные растущие стадии: кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые. Шизонты - делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые), с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые, представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с обособленными ядрами и цитоплазмой. В динамике эритроцитарная шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит, внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется - кольцевидный трофозоит. На этой стадии цитоплазма имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки. По мере роста паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся по форме и числу, псевдоподии - образуется амебовидный трофозоит. В дальнейшем у развивающегося трофозоита постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и количество цитоплазмы - образуется зрелый трофозоит. Зрелый трофозоит - округлая или несколько вытянутая клетка с относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита. Затем наступает стадия шизонта, начинается попарное деление ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь вокруг каждого из дочерних ядер - образуется зрелый шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для каждого вида плазмодиев (см. таблицы). При отсутствии или неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты, и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев продолжительностью развития одной генерации. У Р. falciparum, P. vivax, P. ovale - 48 ч, Р. malariae - 72 ч.

В процессе роста паразита в его цитоплазме появляется малярийный пигмент - продукт метаболизма гемоглобина, представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от золотисто-коричневого до черного цвета. Количество пигмента, размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются по мере его перехода в последовательные стадии развития.

У части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются в половые формы, гаметоциты - женские (макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты). Мужские и женские гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли, характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом. Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) - Р. falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем бесполых форм. При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р. vivax, Р. ovale, P. malariae значительно отличаются от гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания, появления в периферической крови и сохранения способности заражать переносчика (самок комара Р. anopheles).

Р. vivax, Р. ovale и Р. malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической крови. Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных эритроцитов к стенкам таких капилляров. В периферической крови обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только самые молодые стадии - кольцевидные трофозоиты. Их число очень быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании периферической крови в начале болезни можно получить неправильное представление об истинном числе паразитов. При осложненном течении в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением сосудистого тонуса.

При оценке результатов исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов крови).

4. Принцип метода паразитологической диагностики малярии

Паразитологическая диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно только в период его развития в эритроците. Для обнаружения плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом "тонкого мазка" и "толстой капли", окрашенные по Романовскому-Гимза. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод - "толстая капля". Благодаря распределению относительно большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз большее, чем в "тонком мазке", что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии. Начинать надо всегда с просмотра "толстой капли".

Чувствительность метода "толстой капли" такова, что при просмотре 100-150 полей зрения можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови. Концентрация исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы, "толстую каплю" окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации. Несмотря на определенную специфичность, такая деформация иногда может препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром "толстой капли" можно только, если вид паразита был первоначально установлен. "Толстая капля" относительно быстро позволяет выявить и других паразитов крови: трипаносом, микрофилярий, спирохет, бабезий и др. Отрицательный паразитологический результат изучения "толстой капли", но повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов позволяет предположить перенесенную недавно малярию (при отсутствии соответствующих анамнестических данных), обнаружение повышенного содержания лейкоцитов, их видовой состав, а также повышенное содержание остатков незрелых эритроцитов, позволяют предположить иное заболевание, не связанное с малярией.

В "тонком мазке", фиксированном до окраски, сохраняются морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и присущие данному виду паразита. Большое значение для дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных эритроцитов. "Тонкий мазок" крови делают в дополнение к "толстой капле". В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен, для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом "толстой капли".

5. Необходимые реактивы и оборудование

1. Этиловый спирт 96°.

2. Азур-эозин по Романовскому-Гимза (промышленный маточный раствор или сухая краска).

3. Метиленовый синий.

4. Этиловый эфир.

5. Глицерин.

6. Тетраборат натрия (бура).

7. Калий фосфат однозамещенный безводный - KHPO.

8. Натрий фосфат двузамещенный безводный - NaHPO.

9. Смесь Никифорова (смесь этилового спирта и эфира в равных частях).

10. Дистиллированная вода.

11. Индикаторная бумага (диапазон рН 5,0-8,0).

12. Фильтровальная бумага.

13. Химическая посуда: мерные цилиндры или стаканы на 10, 50 и 100 мл; градуированные центрифужные пробирки; колбы и стаканы; стеклянные палочки.

14. Предметные стекла

15. Шлифованные стекла.

16. Фарфоровая ступка с пестиком.

17. Аптечные равноплечие или электронные весы.

18. Эмалированные кюветы.

19. Пинцеты.

20. Часы песочные или сигнальные.

21. Стеклянные мостики или специальные контейнеры для окрашивания препаратов крови.

22. Скарификаторы стерильные одноразовые.

23. Бинты стерильные, вата.

24. Перчатки резиновые.

25. Микроскоп с осветителем (объективом х90 или х100, окуляром х7; х10).

26. Термостат.

27. Холодильник.

6. Техника паразитологической диагностики

     
6.1. Подготовка предметных стекол

1. Предметные стекла новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1 каплю фенолфталеина - появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла протирают чистой хлопчатобумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло), где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной стираной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую (!) бумагу небольшими партиями и стерилизуют.

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать не рекомендуется. При необходимости их использования, следует удалить следы иммерсионного масла простиранной ветошью, затем отмыть каждое стекло от окрашенных препаратов крови в теплом мыльном растворе (для этой цели удобно использовать зубную щетку с коротко срезанной щетиной). Дальнейшая обработка - такая же, как и новых стекол.