ГОСТ 20264.2-88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности (с Изменением N 1)

3. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ МЕТОДОМ ФОЛП
(для определения щелочных протеиназ при рН 10,5)

За единицу протеолитической активности принята способность фермента катализировать гидролиз 1 г белка (казеина) в строго определенных условиях: температуре 40 °С, рН 10,5 и времени гидролиза 1 ч.

3.1. Аппаратура, материалы, реактивы, растворы

Применяемая аппаратура и материалы по п.2.2.

Казеин по Гаммерстену.

Натрий углекислый по ГОСТ 83, раствор концентрации 0,2 моль/дм и 0,5 моль/дм.

Натрий двууглекислый по ГОСТ 2156, раствор концентрации 0,2 моль/дм.

Трихлоруксусная кислота (ТХУ), раствор концентрации 0,3 моль/дм.

Натрия гидроокись, раствор концентрации 1 моль/дм.

Реактив Фолина по п.2.3.4.

3.2. Подготовка к испытанию

3.2.1. Приготовление раствора ферментного препарата

0,100-1,000 г исследуемого препарата (в зависимости от предполагаемой активности) тщательно растирают с небольшим количеством дистиллированной воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 см, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают. Из этого раствора готовят не менее двух разведений в зависимости от предполагаемой активности.

Каждое разведение испытуемого раствора анализируют в двух повторностях.

Для испытания берут две параллельные навески препарата.

Раствор ферментного препарата готовят непосредственно перед определением.

3.2.2. Приготовление карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с рН 10,7

Для приготовления буферного раствора в мерную колбу вместимостью 200 см наливают 45 см раствора углекислого натрия концентрации 0,2 моль/дм и 5 см раствора двууглекислого натрия. Объем доводят до метки дистиллированной водой.

3.2.3. Приготовление раствора с массовой долей казеина 1% (субстрат)

2,000 г казеинового порошка переносят в коническую колбу вместимостью 250 см и приливают 140 см карбонатно-бикарбонатного буферного раствора с концентрацией водородных ионов рН 10,7. Колбу ставят на магнитную мешалку и раствор перемешивают в течение 30 мин, затем, продолжая перемешивать, колбу с субстратом помещают в водяную баню и нагревают до температуры 40 °С; рН при этой температуре доводят до 10,5 добавлением (если необходимо) раствора гидроокиси натрия концентрации 1 моль/дм. Далее раствор субстрата из конической колбы переводят в мерную колбу вместимостью 200 см, охлаждают проточной водой до 20 °С и объем субстрата доводят до метки карбонатно-бикарбонатным буферным раствором. Срок хранения субстрата в холодильнике не более 3 сут в плотно закрытой склянке.

3.3. Проведение испытания

В три пробирки (одна контрольная) наливают по 5 см раствора казеина и выдерживают в ультратермостате при температуре 40 °С в течение 5 мин.

В первую пробирку (контрольную) добавляют 2,5 см дистиллированной воды, в последующие - по 2,5 см испытуемого раствора ферментного препарата.

Содержимое пробирок тщательно перемешивают и выдерживают в ультратермостате в течение 60 мин при температуре 40 °С.

По истечении времени гидролиза в каждую из пробирок, начиная с первой (контрольной), добавляют по 5 см раствора ТХУ, чтобы прервать ферментативную реакцию и осадить белок и высокомолекулярные продукты гидролиза.