ГОСТ 12044-93 Семена сельскохозяйственных культур. Методы определения зараженности болезнями (с Поправкой)

     9 Метод анализа зародышей (эмбрионов)

9.1 Метод применяют для обнаружения мицелия пыльной головни (Ustilago sp.) в эмбрионах семян пшеницы и ячменя, отделенных от эндосперма.

9.1.1 Отбор проб

Для анализа используют семена основной культуры, выделенные из навески массой 100 г для пшеницы и 120 г для ячменя.

9.1.2 Проведение анализа

9.1.2.1 Перед отделением зародышей (эмбрионов) семена ячменя для отделения пленок помещают на 40 мин в 50%-ный раствор серной кислоты. (Концентрированную химически чистую кислоту разбавляют вдвое, наливая кислоту в воду).

Затем семена тщательно перемешивают, промывают проточной водой, а остатки пленок оттирают на решете капроновой щеткой.

9.1.2.2 Эмбрионы семян пшеницы и ячменя отделяют от эндосперма двумя способами.

Первый способ. Семена замачивают в стеклянной или эмалированной посуде в 1 дм горячего свежеприготовленного раствора щелочи (KОН или NaOH, 100 г на 1 дм воды), в котором растворен анилиновый синий краситель для хлопчатобумажных тканей в количестве 1 г на 1 дм щелочи, и оставляют в термостате при 24°С на 12-24 ч. Содержимое изредка перемешивают стеклянной палочкой; при этом зародыши отделяются у 80% - 90% семян. В раствор щелочи вместо анилинового синего красителя можно добавлять трипановый синий "для микро" в такой же концентрации. Затем содержимое из посуды пропускают через лабораторные решета, вставленные одно в другое, диаметром отверстий 5, 3 и 1 мм и промывают проточной водой. Зародыши оседают на последнем решете диаметром отверстий 1 мм. Отделившиеся окрашенные зародыши переносят в колбу вместимостью 250 см с 20%-ным раствором щелочи (200 г на 1 дм воды), взятой в количестве 200 см, и кипятят в течение 10-15 мин. Затем зародыши переносят в чайное ситечко, тщательно промывают проточной водой, переносят в колбу с 50%-ной молочной кислотой и снова кипятят 1 мин.

Второй способ. Семена помещают в эмалированную или стеклянную посуду, заливают 3%-ным раствором щелочи и кипятят около 1 ч до полного отделения зародышей от эндосперма. Затем содержимое из посуды пропускают через набор лабораторных решет с диаметром отверстий 5, 3 и 1 мм с последующей промывкой их проточной водой. Зародыши, оставшиеся на последнем решете, переносят в колбу вместимостью 250 см и кипятят 40 мин в 15% - 20%-ном растворе щелочи, взятой в количестве 200 см, после чего их тщательно отмывают от щелочи. Отмытые зародыши помещают в стеклянный бюкс или колбу, где налито небольшое количество раствора анилинового синего или трипанового синего красителя в концентрации 0,1%, доводят до кипения на электроплитке или спиртовке и кипятят в течение 10-20 с. При работе с химикатами следует соблюдать меры предосторожности. Потеря зародышей после всех операций не должна превышать 20%. Зародыши можно хранить в 50%-ном водном растворе глицерина. После кипячения каждый зародыш просматривают под микроскопом или бинокулярной лупой при увеличении (12-15). В поле зрения должен быть виден один зародыш. Покровным стеклом зародыш накрывать не следует.

9.1.2.3 Зародыши располагают в рядки, очерченные восковым карандашом, с помощью препаровальных игл или небольшого скальпеля, и просматривают под микроскопом на предметном стекле или в чашках Петри. Зародыши необходимо просматривать в основном со стороны зародышевой почки, корешков и колеоптиля (приложение Е), где может располагаться мицелий, и со стороны щитка. Грибница головни при малом увеличении микроскопа представляет собой комочки спутанных гифов мицелия. Гифы окрашены в сине-голубой цвет, имеют толщину 3 мкм. Встречаются редкие случаи, когда в ткани щитка находятся другие грибы помимо головни, но они имеют другое строение и ясно различимы.

9.1.3 Обработка результатов

Подсчитывают все инфицированные зародыши независимо от места локализации мицелия в органах эмбриона и вычисляют их содержание в процентах к числу просмотренных зародышей. Например, всего проанализировано 2000 зародышей, из них пораженных оказалось 10; процент поражения составляет 0,5%.