ГОСТ 29139-91 Мука, хлеб и хлебобулочные изделия пшеничные витаминизированные. Метод определения витамина В(2) (рибофлавина) (с Поправкой)

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1. Рибофлавин определяют в двух параллельных навесках продукта.

4.2. Гидролиз

Навеску продукта массой 10,0 г* помещают в колбу вместимостью 250 см и приливают 150 см раствора соляной кислоты концентрации 0,1 моль/дм.

___________________

* Масса навески должна обеспечить концентрацию рибофлавина в измеряемом растворе в диапазоне 0,04-0,25 мкг/см, что при данных навеске и разведениях будет соответствовать содержанию рибофлавина в продукте 0,10-0,60 мг/100 г.

Гидролиз осуществляют на кипящей водяной бане в течение 40 мин, закрыв горло колбы воронкой диаметром 35 мм.

Содержимое колбы следует периодически перемешивать, особенно в первые 5 мин.

По окончании гидролиза колбу охлаждают до комнатной температуры и с помощью насыщенного водного раствора уксуснокислого натрия доводят рН гидролизата до 4,5±0,1 (потенциометрически).

После этого к гидролизату добавляют навеску амилоризина массой 0,10 г, 2-3 капли толуола и затем колбу помещают в термостат на 14-16 ч при температуре 37°С. После этого гидролизат охлаждают, доводят его объем до 250 см дистиллированной водой и фильтруют. В фильтрате определяют содержание рибофлавина.

Если имеется необходимость прервать анализ на 1-2 дня, то перед доведением объема до 250 см гидролизат кипятят 5 мин, охлаждают, доводят объем до 250 см и фильтруют.

Одновременно аналогичным образом готовят контрольный раствор на содержание рибофлавина в амилоризине, используя то же количество ферментного препарата и реактивов, но без навески исследуемой пробы.

До проведения анализа фильтрат хранят в холодильнике в плотно закрытой колбе.

4.3. Очистка гидролизата от примесей, мешающих определению

К 100 см фильтрата добавляют 2 см раствора серной кислоты концентрации 0,3 г/см и с помощью пипетки или бюретки по каплям раствор марганцовокислого калия концентрации 0,03 г/см, постоянно перемешивая до получения малинового окрашивания.

Избыток марганцовокислого калия удаляют добавлением по каплям раствора перекиси водорода до обесцвечивания фильтрата.

Количество израсходованных растворов серной кислоты, марганцовокислого калия и перекиси водорода (в кубических сантиметрах) приплюсовывают к первоначально взятому на окисление объему фильтрата, чтобы определить конечный объем раствора.

Полученный раствор переносят в делительную воронку, добавляют 30-50 см хлороформа и встряхивают в течение 1 мин. После разделения слоев хлороформный слой (нижний) отбрасывают, а водную фазу используют для дальнейшего определения.

4.4. Фотолиз

Фотолиз проводят в пяти конических колбах с притертыми пробками.

В четыре колбы наливают по 20 см очищенного гидролизата, в две из которых добавляют по 2 см рабочего стандартного раствора рибофлавина.

В пятую колбу наливают 20 см контрольного раствора.

Во все пять колб добавляют по 4 см раствора гидроокиси натрия концентрации 7 моль/дм, закрывают колбу пробками, перемешивают содержимое и облучают их светом двух светильников с лампами накаливания по 100 Вт каждая с расстояния 30 см в течение 40 мин.

Температура окружающего воздуха должна быть не более 25°С. Для поддержания указанной температуры воздуха используют настольный вентилятор.

Немедленно по окончании облучения растворы во всех колбах подкисляют 4 см ледяной уксусной кислоты, добавляют к ним по 20 см хлороформа, закрывают притертыми пробками и встряхивают в течение 2 мин, избегая образования эмульсии.

Затем все колбы оставляют на 10-15 мин для расслоения водной и хлороформной фаз.

После этого пипеткой отбирают по 10-12 см хлороформного раствора (нижний слой), который фильтруют через бумажный фильтр с безводным сернокислым натрием в флюорометрические пробирки.

Время с момента начала фильтрации раствора люмифлавина до измерения его флюоресценции не должно превышать 30 мин.

4.5. Измерение флюоресценции хлороформного раствора