ГОСТ 21237-75 Мясо. Методы бактериологического анализа (с Изменениями N 1, 2)

3. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ

3.1. Приготовление питательных сред, реактивов, красок

3.1.1. Приготовление мясо-пептонного агара

К 1000 см мясо-пептонного бульона перед стерилизацией добавляют 20 г агара и кипятят на слабом огне при постоянном помешивании до полного растворения.

Мясо-пептонный агар, охлажденный до температуры 50-55 °С, осветляют яичным белком (из расчета один белок на 1000 см мясо-пептонного агара), помещают в автоклав, не завинчивая крышку автоклава, или в аппарат Коха на 1 ч, чтобы белок свернулся и, оседая, увлек за собой взвешенные частицы. Горячий мясо-пептонный агар фильтруют через ватно-марлевый фильтр, устанавливают в нем рН 7,0-7,4, разливают во флаконы или пробирки и 20 мин стерилизуют в автоклаве при температуре 120 °С.

3.1.2. Приготовление основного раствора Хоттингера

1000 г мяса, освобожденного от жира и сухожилий, нарезают кусками размером 1-2 см и опускают небольшими порциями в кастрюлю с двойным количеством кипящей водопроводной воды. Кипятят в течение 15-20 мин, пока цвет мяса не станет серым; это указывает на то, что белки свернулись. Мясо вынимают шумовкой и измельчают на мясорубке. Оставшуюся жидкость фильтруют и в ней устанавливают рН 8,0. Фарш опускают в отфильтрованную жидкость и охлаждают до температуры 40 °С в открытой кастрюле, затем добавляют очищенную от жира, соединительной ткани и дважды измельченную поджелудочную железу в количестве 10% к полученной взвеси (на 1000 см жидкости 100 г железы) или сухой панкреатин в количестве 0,5-1,0% (в зависимости от его активности). Полученную смесь хорошо размешивают, после чего снова подщелачивают 10%-ным раствором гидроокиси натрия до рН 7,8-8,0 и повторяют такое же подщелачивание через 30 мин. Отсутствие сдвига реакции смеси указывают на его доброкачественность.

После установления рН смесь переливают в бутыль с хорошо подобранной резиновой пробкой с таким расчетом, чтобы часть бутыли оставалась свободной. Затем добавляют в количестве 1-3% от объема хлороформа (в холодное время года - меньше, чем в теплое), закрывают бутыль пробкой и несколько раз встряхивают, после чего вынимают пробку для удаления избытка хлороформа и тут же снова закрывают.

Через 1-2 ч после добавления поджелудочной железы или панкреатина проверяют реакцию, устанавливают рН 7,4-7,6 и оставляют смесь для переваривания на 7-16 суток при комнатной температуре до образования аморфного осадка.

Первые 3-4 суток переваривания ежедневно проверяют реакцию среды и поддерживают рН на уровне 7,4-7,6. В течение этого времени встряхивают жидкость не менее трех раз в сутки так же, как указано выше. В дальнейшем встряхивать можно реже.

За 1-2 суток до окончания переваривания встряхивание прекращают, чтобы гидролизат отстоялся. Конец переваривания характеризуется следующими признаками: на дне бутылки собирается аморфный осадок; жидкость над осадком просветляется и принимает соломенно-желтый цвет; гидролизат легко фильтруется; реакция на триптофан с бромной водой должна быть положительной (в пробирку наливают 3-4 см фильтрованного гидролизата, добавляют три-четыре капли бромной воды); при наличии триптофана жидкость принимает розово-фиолетовый цвет, в то время как контрольная пробирка с гидролизатом без бромной воды имеет желтое окрашивание. 5%-ный гидролизат должен содержать 1,1-1,2% общего азота. После гидролиза жидкость фильтруют через полотняный или бумажный фильтр, сливают в бутыль и стерилизуют в течение 30 мин при температуре 120 °С.

Приготовленную среду можно хранить пять месяцев. Перед употреблением жидкость фильтруют.

(Измененная редакция, Изм. N 2).

3.1.3. Приготовление бульона Хоттингера

К 100 см основного раствора добавляют 500 см водопроводной воды, 3 г хлористого натрия и 0,12 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Полученный раствор кипятят в течение 10 мин, фильтруют, устанавливают рН 7,2-7,4 и стерилизуют в течение 20 мин при температуре 120 °С.

3.1.4. Приготовление физиологического раствора

В 1000 см дистиллированной воды растворяют 8,5 г химически чистого хлористого натрия. Раствор доводят до кипения, охлаждают, фильтруют через бумажный фильтр, разливают в колбы или пробирки и стерилизуют 20 мин в автоклаве при температуре 120 °С.

3.1.5. Приготовление среды Левина

К 100 см расплавленного мясо-пептонного агара с рН 7,0-7,4, приготовленного по п.3.1.1, добавляют 2 см 0,5%-ного водного раствора предварительно подогретой на водяной бане метиленовой сини, 1,5 см 2%-ного раствора эозина (бактериологического), 2 г лактозы и 0,2 г двузамещенного фосфорнокислого калия. Растворы красок готовят на дистиллированной воде и стерилизуют 1 ч при температуре 100 °С. После добавления всех компонентов в указанном порядке среду тщательно перемешивают, разливают в чашки и подсушивают. Среда должна иметь красно-фиолетовый цвет.

Среда Левина может быть приготовлена из сухой стандартной среды по прописи, указанной на этикетке.

3.1.6. Среды фуксин-сульфитный агар (среда Эндо), бактоагар Плоскирева, висмут-сульфит агар (среда Вильсон-Блера) могут быть приготовлены из сухих стандартных сред по прописи, указанной на этикетке.

3.1.7. Приготовление среды Мюллера

Для приготовления среды Мюллера вначале готовят растворы серноватистокислого натрия и Люголя.

В мерный цилиндр с 50 г серноватистокислого натрия добавляют до 100 см дистиллированной воды. Раствор переливают в бутыль и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин.