Аспирированное содержимое одного или нескольких фолликулов сразу же подвергается микроскопированию. Для этого аспират выливают в стерильную чашку Петри и просматривают под бинокулярной лупой с 10-50-кратным увеличением. Обнаруженные ооциты переносят с помощью пастеровской пипетки или специального капилляра в стерильную чашку Петри, содержащую 2-3 мл питательной среды. Для культивирования эмбрионов разработан ряд питательных сред. Наиболее удобны для применения готовые питательные среды, например, Менезо В2 (Фирма Биомерью, Франция). Существуют и другие питательные среды, которые требуют добавлений в них некоторых компонентов.
Далее проводится морфологическая оценка ооцитов по ряду критериев, в которых учитывается плотность и вязкость кумулюса, "рыхлость" лучистого венца и состояние самого ооцита (наличие в нем полярного тельца).
Более точную оценку ооцитов можно проводить с использованием микроскопа с увеличением в 100 и 200 раз. Желательно использование для этого так называемой оптики Номарского.
Зрелые ооциты переносят в чашки для культивирования. Наиболее удобными являются четырехлуночные чашки (фирма NUNC, Дания). В каждую лунку, содержащую 0,5 мл питательной среды, помещают не более 3-4 ооцитов. В центр чашки наливают 2-3 мл дистиллированной воды для поддержания в камере влажности. Далее чашку с ооцитами помещают в термостат при температуре 37 градусов Цельсия с содержанием в газовой среде 5% СО2 и с влажностью до 95%.
В течение 4-6 часов зрелые ооциты инкубируются в термостате, проходя так называемую стадию адаптации, во время которой они адаптируются к условиям in vitro, а часть ооцитов завершает этап созревания, т.к. практически трудно бывает сделать окончательный вывод о зрелости всех ооцитов, помещенных в термостат.
Перед добавлением сперматозоидов к яйцеклеткам, сперматозоиды должны пройти так называемую капацитацию, т.е. приобрести способность к оплодотворению. Суть этого процесса заключается в "отмывании" сперматозоидов от элементов семенной плазмы, содержащей вещества, ингибируюшие активность сперматозоидов. Проводится двукратное центрифугирование отмытых сперматозоидов в специальной среде. Среда выпускается фирмой BISEF, Франция. Среду добавляют из расчета: на 1 мл спермы - 5 мл среды. После второго центрифугирования на осадок осторожно наслаивают несколько капель среды Менезо В2. Подвижные сперматозоиды всплывают в течение 40 минут. Надосадочную жидкость с жизнеспособными сперматозоидами отсасывают капилляром и используют для оплодотворения ооцитов. Осеменение ооцитов проводят добавлением в питательную среду сперматозоидов из расчета не менее 50000 сперматозоидов в 1 мл.
Проникновение сперматозоида через прозрачную зону ооцита в переветеллиновое пространство происходит примерно через 5-7 часов после добавления их в питательную среду, к этому времени яйцеклетки завершают 2-е деление мейоза, формируется пронуклеус.
После объединения ядра сперматозоида с ядром ооцита наступает стадия зиготы. На этой стадии эмбрионы переносят в новую лунку с чистой питательной средой. Как правило, через 24 часа от начала инсеминации отмечается первое дробление зиготы. Возникает стадия 2 бластомеров, которую можно обозначить как ранний эмбрион.
Стадии 2-4-8 бластомеров считаются оптимальными для переноса эмбрионов в полость матки.
Перенос эмбрионов в полость матки осуществляется специальными катетерами в минимальном количестве питательной среды (20-30 мкл). В полость матки рекомендуется переносить не более 3-4 эмбрионов, т.к. при переносе большего количества эмбрионов возможна имплантация двух и более эмбрионов.
После переноса эмбриона в матку содержимое катетера повторно просматривают под лупой с целью контроля возможности задержки части эмбрионов в катетере.