• Текст документа
  • Статус
Оглавление
Поиск в тексте
Действующий

УТВЕРЖДАЮ
Главный государственный санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель Министра здравоохранения
Российской Федерации
Г.Г.Онищенко
9 января 2004 года

Дата введения: 1 февраля 2004 года

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

МУ 2.3.2.1830-04


2.3.2. ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ

Микробиологическая  и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов

1. Разработаны ГУ Научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии им.Н.Ф.Гамалеи РАМН: А.Л.Гинцбург - руководитель, Н.А.Зигангирова, Б.С.Народицкий, Л.Н.Нестеренко, И.А.Шагинян, М.Ю.Чернуха, Ю.В.Ананьина; Министерством здравоохранения РФ, Департаментом Госсанэпиднадзора МЗ РФ: Г.Г.Онищенко, А.И.Петухов; Институтом питания РАМН: В.А.Тутельян, С.А.Шевелева; Институтом вакцин и сывороток им.И.И.Мечникова РАМН: Б.Ф.Семенов; Московским государственным университетом прикладной биотехнологии Министерства общего и профессионального образования Российской Федерации: И.А.Рогов, А.Ф.Валихов, В.И.Ганина.

2. Утверждены 9 января 2004 года, введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации с 1 февраля 2004 года.

3. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению микробиологической и молекулярно-генетической оценки пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов (далее - ГММ).

1.2. Методические указания предназначены для учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющих государственный санитарно-эпидемиологический надзор, а также для других учреждений, аккредитованных на проведение работ в этой области в установленном порядке.

1.3. Требования, изложенные в настоящих методических указаниях в отношении пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, применяются на этапах постановки на производство, санитарно-эпидемиологической экспертизы, выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе, закупки, ввоза в страну и реализации.

1.4. Методические указания разработаны с целью обеспечения единого, научно обоснованного подхода к оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, на этапах разработки, экспертизы и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения для этой продукции.

1.5. Производитель пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, предназначенной для реализации на территории Российской Федерации, при маркировке должен вносить информацию на этикетку об использовании ГММ в соответствии с установленным порядком.

2. Нормативные ссылки

2.1. Федеральный закон "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30.03.99.

2.2. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" N 2-ФЗ и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" от 9 января 1996 года (ред. от 30.12.2001).*
________________
* Вероятно, ошибка оригинала. Название и дату принятия Федерального закона следует читать: "Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Закон Российской Федерации "О защите прав потребителей" и Кодекс РСФСР об административных правонарушениях" N 2-ФЗ от 9 января 1996 года (ред. от 30.12.2001)". - Примечание "КОДЕКС".

2.3. Федеральный закон "О качестве и безопасности пищевых продуктов" N 29-ФЗ от 02.01.2000.

2.4. Федеральный закон "О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" N 86-ФЗ от 05.06.96 (ред. от 12.07.2000).*
___________
* Вероятно, ошибка оригинала. Дату принятия Федерального закона N 86-ФЗ следует читать: "05.07.96" - Примечание "КОДЕКС".

2.5. Федеральный закон "О внесении изменений и дополнений в Федеральный закон о государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности" N 96-ФЗ от 21.06.2000.*
________________
* Вероятно, ошибка оригинала. Дату принятия Федерального закона N 96-ФЗ следует читать: "12.07.00" - Примечание "КОДЕКС".

2.6. "Основы законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан" от 22 июля 1993 года N 5487-1 (ред. от 30.06.2003).

2.7. Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства Российской Федерации N 554 от 24.07.2000.

2.8. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" N 7 от 06.04.99.

2.9. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" N 149 от 16.09.2003.

2.10. Гигиенические требования к безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.1078-01.

2.11. Приказ Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" N 325 от 15.08.2001 (ред. от 18.03.2002) (зарегастрированный в МЮ РФ 19.10.2001 N 2978).

3. Порядок санитарно-эпидемиологической экспертизы и выдачи санитарно-эпидемиологического заключения пищевой продукции, полученной с использованием ГММ

3.1. Вся пищевая продукция, полученная с использованием жизнеспособных микроорганизмов, проходит санитарно-эпидемиологическую экспертизу в установленном порядке. Заявитель должен декларировать наличие генных модификаций у штаммов, используемых для производства продуктов питания.

3.2. Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы и выдачи заключения по санитарно-эпидемиологической экспертизе пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, осуществляется в соответствии с порядком, установленным:

- постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О порядке гигиенической оценки и регистрации пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников" N 7 от 06.04.99;

- постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации "О проведении микробиологической и молекулярно-генетической экспертизы генетически модифицированных микроорганизмов, используемых в производстве пищевых продуктов" N 149 от 16.09.2003;

- приказом Минздрава РФ "О санитарно-эпидемиологической экспертизе продукции" N 325 от 15.08.2001 (ред. от 18.03.2002) (зарегистрированным в МЮ РФ 19.10.2001 N 2978).

3.3. Юридические лица и индивидуальные предприниматели представляют в центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Министерства здравоохранения Российской Федерации комплект документов и материалов, включающий:

- заявку (письмо) на проведение гигиенической оценки и санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;

- материалы, отражающие медико-генетическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;

- материалы, отражающие технологические свойства пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;

- материалы, отражающие медико-биологическую оценку пищевой продукции, полученной с использованием ГММ;

- материалы, отражающие молекулярно-биологические и микробиологические характеристики ГММ:

1) документацию, подтверждающую таксономическую принадлежность штамма, установленную по фенотипическим и генотипическим свойствам (паспорт штамма);

2) название штамма, соответствующее кодам Международной номенклатуры;

3) свидетельство о депонировании штамма;

4) документацию, содержащую сведения о фенотипических и генотипических характеристиках штамма, включая информацию о наличии плазмид;

5) документацию, подтверждающую происхождение и подлинность микроорганизма-реципиента, включая документацию о всех известных генетических модификациях его, индуцированных как генно-инженерными, так и традиционными методами;

6) источник и нуклеотидную последовательность целевого гена и его регуляторных элементов;

7) цель генной модификации,

8) происхождение и таксономическое положение штамма-донора, установленные методами молекулярной геносистематики;

9) характеристику средств доставки целевого гена в клетки реципиента (физическую карту вектора, наличие полилинкеров и селективных маркеров);

10) стабильность интеграции чужеродной ДНК в хромосому или плазмиду ГММ;

11) использование транспозонов при конструировании штаммов ГММ;

12) фенотипические, биологические, патогенные свойства ГММ, взаимодействие с резидентной флорой кишечника человека;

13) стабильность генотипических и фенотипических характеристик ГММ;

14) способность к передаче генетического материала от ГММ в резидентную флору кишечника человека и в клетки макроорганизма.

Кроме вышеперечисленного, заявитель должен предоставить сведения об официальном разрешении на применение в пищевой промышленности и/или в свободной продаже населению и о разрешении на экспорт из страны продукта с данным ГММ (оригиналы или заверенные копии документов установленного образца).

3.4. Объем и программа проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертами ГУ НИИ питания РАМН и Центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им.Гамалеи РАМН по результатам экспертизы представленных материалов, а также в зависимости от ее принадлежности к пищевым продуктам на основе:

- новых штаммов, не имеющих разрешения на применение в производстве пищевых продуктов;

- штаммов, проходивших ранее экспертизу в установленном порядке и допущенных в качестве заквасочных, стартовых, пробиотических, дрожжевых культур и штаммов-продуцентов пищевых веществ и пищевых добавок и используемых в пищевой промышленности.

Кроме того, при этом учитывается группа продукции по признаку наличия ГММ в жизнеспособном состоянии на момент потребления:

1) пищевые продукты, содержащие ГММ в живом состоянии, - кисломолочные, пробиотические продукты, напитки брожения и пиво непастеризованные, закваски и стартовые культуры, готовые мясные продукты, изготовленные с использованием стартовых культур;

2) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ, и в которых в процессе технологии они были инактивированы (напитки брожения и пиво пастеризованные, термизированные кисломолочные продукты и др.);

3) пищевые продукты, изготовленные при помощи ГММ, и которые в дальнейшем освобождены от них в процессе производства (ферментные препараты, белки).

Для концентрации внимания экспертизы на продукции, представляющей наибольший риск, последняя группа подразделяется на "негативный" и "позитивный" листы, при этом в негативный лист включаются полученные при использовании ГММ продукты, не содержащие белка и ДНК (пищевые кислоты, витамины, жирные кислоты) и ферменты для спиртовой промышленности.

Работа по экспертизе продукции, включенной в негативный лист, должна предусматривать первоочередный анализ документальных материалов, и в случае необходимости - анализ при помощи лабораторных методов.

3.5. Для проведения работ по оценке качества и безопасности пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, фирма-изготовитель поставляет образцы продукции и используемые культуры штаммов ГММ в количестве, необходимом для проведения полного объема исследований.

3.6. На основании экспертизы представленных документов и материалов и результатов проведенных молекулярно-генетических, микробиологических и технологических исследований продукции центр санитарно-эпидемиологического нормирования, гигиенической сертификации и экспертизы Минздрава России оформляет бланк санитарно-эпидемиологического заключения (или мотивированное заключение об отказе) и передает его на подпись в Департамент госсанэпиднадзора Минздрава России. Санитарно-эпидемиологическое заключение подписывается Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, а в его отсутствие - начальником Департамента госсанэпиднадзора, заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации.

4. Микробиологическая оценка ГММ, используемых для производства пищевой продукции


Необходимость проведения тех или иных исследований по данному разделу и для каждого конкретного вида пищевой продукции, полученной с использованием ГММ, определяется экспертом центра по экспертизе ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН.

4.1. Сравнительный анализ фенотипических свойств ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма

4.1.1. Сущность метода


Сравнительный анализ фенотипических свойств основан на идентификации основных фенотипических свойств исследуемого ГММ, штамма-реципиента или референтного штамма того же вида для определения стабильности фенотипических признаков.

Оптимальными методами исследования фенотипических свойств являются методы идентификации микроорганизмов с помощью диагностических панелей, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенных к использованию в установленном порядке. Данные системы одноразового пользования предназначены для определения биохимической активности и последующей идентификации в течение 18-24 часов. Дополнительными методами исследования фенотипических свойств являются чувствительность к антибиотикам, к бактериофагам (для некоторых видов ГММ).

4.1.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды

4.1.2.1. Аппаратура и инструментарий

НД (ГОСТ, ТУ)

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений РН ± 0,01

ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160±5)°С

ТУ 64-1-28-70-76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 28-37°С с отклонением от заданной ± 1°С

ТУ 64-1-1382-72

Баня водяная с подогревом

ГОСТ 12026-76

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Микроскоп биологический МБИ-2, МБИ-3, МБР-3

ГОСТ 8284-78

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды

ГОСТ 6709-72

Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов

ТУ 16-535-84

Холодильник бытовой электрический

Пинцет медицинский

ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские

ГОСТ 21239-89

Скальпель хирургический, 15 см

ГОСТ 21240-89

Штативы для пробирок

Часы механические сигнальные

ГОСТ 3145-84

Микроволновая печь

4.1.2.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Бутыли стеклянные для химических реактивов

Кастрюли эмалированные

ГОСТ 24778-81

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные

ГОСТ 25336-82

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 5556-81

Полистироловые планшеты U-образные

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Стекла предметные для микропрепаратов

ГОСТ 6672-75

Ступка фарфоровая с пестиком

ГОСТ 9147-80

Термометр ртутный с диапазоном измерения от 0 до 100°С (цена деления шкалы 1°С)

ГОСТ 13646-68

Чашки биологические (Петри)

ГОСТ 23932-90

Книга-каталог кодов для идентификации

Бланки для регистрации результатов

Микробиологические петли

Фломастеры-маркеры

4.1.2.3. Реактивы и питательные среды

НД (ФС, ТУ)

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-84

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-72

D-глюкоза, ч

ГОСТ 6038-79

D-лактоза, 1-водная

ТУ 6-09-22-98-79

Натрий фосфорнокислый однозамещенный, ч

ГОСТ 4198-75

Натрий фосфорнокислый двухзамещенный, хч

ГОСТ 2493-75

Кислота соляная, хч

ГОСТ 3118-77

Натрий хлористый, хч

ГОСТ 4328-77

Масло иммерсионное для микроскопии

ГОСТ 31739-78

Набор реактивов для окраски по Граму

Спирт этиловый ректификованный технический

ГОСТ 18300-87

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ 5962-67

Экстракт дрожжевой*

________________
* Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.

Триптон*

________________
* Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.

Антибиотики разных групп*

________________
* Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.

Диски с антибиотиками*

________________
* Реактивы производства разных фирм, прошедшие государственную регистрацию и разрешенные для использования в установленном порядке.

Питательные среды:

Для определения количества мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов

ТУ 9229-083-00419785-97

Питательный бульон

ТУ 10-02-02-789-176-94

Сухая питательная среда типа АГВ для определения чувствительности к антибиотикам

ТУ 9229-083-00419785-97

Питательная среда Мюллер-Хинтона разных фирм для определения чувствительности к антибиотикам

Сухая питательная среда для определения чувствительности к антибиотикам диффузионным методом

ГОСТ Р 51600-00

Питательные среды для определения энтеробактерий

ТУ 9229-072-00419785-97 ГОСТ 29184-91

Среды для определения дрожжей и микроскопических грибов (агар Сабуро, сывороточный и др.)

ТУ 9229-083-00419785-97
ГОСТ 10444.12-88

Среды для определения S. aureus (типа Байд-Паркера, солевой агар)

ГОСТ 10444.1, п.5.1, п.5.4

Среды для выращивания бифидобактерий, молочнокислых и пропионово-кислых бактерий (ГМС, M17, MRS)

ТУ 10-02-02-789-192-95

Планшеты для идентификации культур, выпускаемых отечественными и зарубежными производителями и разрешенными к использованию в установленном порядке

Реактивы для ряда тестов в зависимости от идентифицируемого вида ГММ

Дезинфицирующий раствор

Микробиологические петли, скальпель

Стандарт мутности по McFarland


Допускается использование других коммерческих питательных сред и диагностических тест-систем аналогичного назначения для проведения исследований фенотипических свойств в соответствии с данным документом. При их применении необходимо руководствоваться рекомендациями изготовителя.

Питательные среды и биологические препараты импортного производства должны иметь сертификат качества ИСО 9000 или EN 29 000.

Питательные среды и препараты отечественного производства должны соответствовать нормативной документации, утвержденной в установленном порядке.

4.1.3. Методика проведения исследования

4.1.3.1. Выделение ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма


Чистую культуру ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма выделяют, пользуясь общепринятыми в микробиологии методами на рекомендованной для данного вида ГММ и штамма-реципиента питательной среде. Например, выделение чистой культуры ГММ вида термофильных стрептококков должно осуществляться со среды типа М17 по ГОСТ 51331-99, а лактобактерий - со среды MRS по ГОСТ 51339-99.

4.1.3.2. Постановка реакции биохимической идентификации ГММ, штамма-реципиента или контрольного (референтного) штамма


Из чистой 18-24 часовой культуры готовят суспензию в стерильной дистиллированной воде. Суспензию тщательно гомогенизируют. Суспензию доводят до определенной мутности по шкале McFarland в зависимости от исследуемого вида ГММ и штамма-реципиента. Неправильно приготовленная суспензия (слишком густая или очень жидкая) может привести к получению ложных результатов.

Параллельно суспензию ГММ, штамма-реципиента или контрольного штамма высевают на питательные среды для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств и/или постановки дополнительных тестов.

Планшет для идентификации извлекают из полиэтиленовой упаковки и на прилагаемом к планшету бланке регистрируют номер ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма.

Суспензию бактерий тщательно встряхивают и в каждую лунку инокулируют определенный объем суспензии (0,1-0,2 смМетодические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов) в зависимости от фирмы-изготовителя и вида исследуемого ГММ и штамма-реципиента.

После инокуляции в ряд лунок может добавляться стерильное вазелиновое масло, полностью закрывающее внесенную суспензию клеток для создания анаэробных условий.

После инокуляции планшет накрывают крышкой и инкубируют 5-24 часа при оптимальной температуре для исследуемого вида ГММ (например, 25-28°С дрожжи, 42°С - лактобациллы).

По окончании инкубации проверяют рост и чистоту культуры методом посевов на селективные жидкие или плотные питательные среды.

В некоторые лунки (например, ферментация индола) могут быть добавлены реактивы. Учет результатов на бета-галактозидазу проводят дважды: через 3-5 часов и через 18-24 часов. Результаты учитывают визуально с помощью таблицы "Интерпретация реакций" и заносят в бланки.

Идентификацию проводят с помощью таблиц и книг-каталогов кодов соответствующих фирм.

Стабильность фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента проверяют методом пассирования ГММ и штамма-реципиента на жидких и плотных питательных средах и дальнейшим через 3-5 пассажей трехкратным тестированием биохимических свойств ГММ и штамма-реципиента. Трехкратное совпадение всех исследованных биохимических реакций, выявленное при неоднократном пассировании культур (не менее 10 пассажей) будет свидетельствовать о стабильности фенотипических признаков ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по 1-2 реакциям будет являться свидетельством необходимости постановки дополнительных тестов на стабильность фено- и генотипических признаков у ГММ и штамма-реципиента. Вариабельность результатов по большему числу реакций будет служить свидетельством нестабильности фенотипических признаков у ГММ.

4.1.3.3. Определение чувствительности к антимикробным препаратам ГММ, штамма-реципиента и
контрольного штамма


Чувствительность к антимикробным препаратам может быть в ряде случаев хорошим маркером фенотипических свойств ГММ и штамма-реципиента. В определенных случаях, а именно тестирования пробиотиков, определение чувствительности к антимикробным препаратам является обязательным тестом в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ.

Основой для выбора антибактериальных препаратов, подлежащих включению в исследование, являются данные о природной устойчивости или чувствительности отдельных видов ГММ или их групп, о распространении среди них приобретенной резистентности, а также о клинической эффективности антибиотиков.

Современные стандартизованные методы оценки антибиотикорезистентности подразделяются на методы серийных разведений и диффузионные. В зависимости от вида ГММ и штамма-реципиента, предназначения ГММ тестирование будет выполняться как методом серийных разведений, так и диффузионным методом.

4.1.3.3.1. Подготовка к анализу

А. Метод серийных разведений


Постановка метода серийных разведений для оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:

а) приготовление растворов антибиотиков;

б) приготовление питательных сред с растворами антибиотиков;

в) приготовление суспензии исследуемого ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма, стандартизация суспензии и инокуляция;

г) инкубация;

д) интерпретация результатов исследования.

Общими и очень важными этапами в методе серийных разведений являются: приготовление растворов антибиотиков, питательных сред, смешивание растворов антибиотиков и питательных сред.

4.1.3.3.2. Приготовление растворов антибиотиков


Используют основные растворы антибиотиков (пригодные для хранения) и рабочие, используемые "ex tempore" для приготовления питательных сред.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000 мкг/мл и выше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора проводят по формуле:


Вес (мг) =

Объем растворителя (мл) х Необходимая концентрация (мкг/мл)

Активность субстанции (содержание антибиотика в мкг/мл)



Из основных растворов готовят рабочие двукратные концентрации антибиотиков. Для приготовления рабочих растворов используется стерильная дистиллированная вода. Расчет навески антибиотика для приготовления основного раствора в случае, если активность антибиотика измеряется в ЕД, производится аналогично.

4.1.3.3.3. Приготовление сред, содержащих антибиотики для серийных разведений


Различают два основных варианта метода серийных разведений в бульоне: макрометод (в пробирках) и микрометод (в планшетах). Рабочие растворы антибиотиков для обоих методов готовят по одинаковой схеме. Отличием является то, что серийные разведения антибиотика делают не в дистиллированной воде, а в жидкой питательной среде. Жидкая питательная среда, прошедшая контроль качества, готовится в соответствии с инструкцией изготовителя.

При постановке методов серийных разведений проводят контроль роста культуры на среде без антибиотика, а качество среды и антибиотиков контролируют с использованием референтных штаммов данного вида. Контролируется также чистота суспензии ГММ, использованного для инокуляции, путем высева на неселективные среды.

4.1.3.3.4. Учет результатов


Учет результатов при постановке макро- и микрометодов проводят визуально по появлению видимой мутности или спектрофотометрически. За МПК принимают концентрацию, обеспечивающую полное подавление видимого роста.

Б. Дискодиффузионный метод


Постановка дискодиффузионного метода оценки антибиотикорезистентности включает следующие этапы:

- приготовление питательных сред;

- приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;

- наложение дисков;

- инкубация;

- учет результатов.

Для получения правильных результатов необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерческих дисков.

4.1.3.3.5. Приготовление питательных сред


Приготовление чашек Петри с плотной питательной средой связано с некоторыми особенностями. Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовителя. Перед заполнением чашки Петри расплавленной питательной средой ее устанавливают на строго горизонтальную поверхность, выверенную по уровню. Толщина агарового слоя должна быть 4,0 мм, что достигается при внесении в чашку Петри диаметром 100 мм 25-30 мл агаровой среды. Соблюдение указанных требований связано с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Перед инокуляцией суспензии чашки с плотной питательной средой контролируют на отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

4.1.3.3.6. Приготовление суспензии и инокуляция


Для приготовления инокулята используют 18-20-часовую агаровую или 5-6-часовую бульонную культуру исследуемого ГММ. Суспензию доводят до мутности стандарта McFarland 0,5 (конечная концентрация около 1-2 х 10Методические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов КОЕ/смМетодические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов).

Приготовленный инокулят в количестве 1-2 мл вносят на поверхность чашки Петри, равномерно по поверхности агара распределяют покачиванием. Избыток суспензии удаляют пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10-15 минут.

4.1.3.3.7. Наложение дисков


Через 15-20 минут после инокуляции на поверхность питательной среды вносят диски с антибиотиками. Диски наносят с помощью автоматического распределителя дисков или стерильным пинцетом. На одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков с расстоянием между краем чашки и диска, а также между дисками 15-20 мм. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

4.1.3.3.8. Инкубация и учет результатов


Чашки после наложения дисков помещают в термостат и инкубируют, перевернув их вверх дном, 18-20 часов при оптимальной температуре для исследуемого ГММ.

После окончания инкубации проводят учет результатов, измеряя диаметр зоны задержки роста с точностью до 1 мм. Для этого пользуются штангенциркулем или кронциркулем, раздвигая их концы до видимой зоны задержки роста и затем, измеряя зону задержки в мм с помощью линейки.

4.2. Определение патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и референтного (контрольного) штамма


При выявлении четко выраженной гемолитической и адгезивной активности ГММ и штамма-реципиента обязательными тестами на патогенные свойства ГММ и штамма-реципиента являются определение вирулентных свойств ГММ и штамма-реципиента с использованием тканевых культур (HeLa, Hep-2, CHO), определением LDМетодические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов на модели беспородных мышей, интраназальной легочной модели, инвазивных свойств на тканевых культурах и в кератоконъюктивальном тесте по Sereny. В зависимости от принадлежности ГММ и штамма-реципиента к определенному виду микроорганизмов выбираются наиболее адекватные методы определения вирулентных и инвазивных свойств ГММ. Ниже приведены методы, которые могут быть использованы в микробиологической и молекулярно-генетической оценке ГММ при приведенных выше условиях.


4.2.1. Определение гемолитической активности ГММ и штамма-реципиента

Определенные виды микроорганизмов продуцируют гемолизины, считающиеся факторами патогенности у бактерий, в связи с чем продукция гемолизина во многих случаях является маркером вирулентности. Определение гемолитической активности проводится в 2 этапа. На 1-м этапе на 5%-ный кровяной агар высевают исследуемый ГММ и штамм-реципиент. При продукции гемолизина через 18-24 часа при культивировании чашек Петри при оптимальной температуре развития гемолиза исследуемым ГММ вокруг колоний образуется видимая зона гемолиза и тем большая, чем больше гемолизина продуцирует ГММ и штамм-реципиент. При выявлении продукции гемолизина ГММ и штаммом-реципиентом проводят 2-й этап исследования, определяя титр гемолитической активности супернатантов ГММ и штамма-реципиента.

4.2.2. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы и питательные среды, используемые для определения патогенных свойств ГММ, штамма-реципиента и контрольного штамма вида, к которому относится ГММ

4.2.2.1. Аппаратура и инструментарий

НД (ГОСТ, ТУ)

Анализатор потенциометрический, погрешность измерений РН ± 0,01

ГОСТ 19881-74

Шкаф сушильный стерилизационный ШСС-80П или других марок, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5)°С

ТУ 64-1-28-70-76

Термостат, позволяющий поддерживать рабочую температуру 28-37°С с отклонением от заданной ± 1°С

ТУ 64-1-1382-72

Баня водяная с подогревом

ГОСТ 12026-76

Весы лабораторные общего назначения, 2 и 4 класса точности, с наибольшим пределом взвешивания 200 г

ГОСТ 24104-88

Стерилизаторы паровые медицинские или аналогичные

ГОСТ 19569-89Е

Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды

ГОСТ 6709-72

Холодильник бытовой электрический

Микроцентрифуга типа "Эппендорф"

Пинцет медицинский

ГОСТ 21241-89

Ножницы медицинские

ГОСТ 21239-89

Скальпель хирургический, 15 см

ГОСТ 21240-89

Штативы для пробирок

4.2.2.2. Лабораторная посуда и материалы

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Бутыли стеклянные для химических реактивов

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Колбы плоскодонные конические или круглые разной вместимости

ГОСТ 1770-74

Воронки стеклянные

ГОСТ 25336-82

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 5556-81

Полистироловые планшеты U-образные

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Ступка фарфоровая с пестиком

ГОСТ 9147-80

Чашки биологические (Петри)

ГОСТ 23932-90

Микробиологические петли

Доступ к полной версии этого документа ограничен

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

Что вы получите:

После завершения процесса оплаты вы получите доступ к полному тексту документа, возможность сохранить его в формате .pdf, а также копию документа на свой e-mail. На мобильный телефон придет подтверждение оплаты.

При возникновении проблем свяжитесь с нами по адресу spp@kodeks.ru

Методические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов

Название документа: Методические указания МУ 2.3.2.1830-04. Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка пищевой продукции, полученной с использованием генетически модифицированных микроорганизмов

Вид документа: Методические указания Главного государственного санитарного врача РФ

Методические указания Минздравмедпрома РФ

Принявший орган: Главный государственный санитарный врач РФ

Минздравмедпром России

Статус: Действующий

Опубликован: Бюллетень нормативных и методических документов Госсанэпиднадзора, N 1, март, 2004 год
Дата принятия: 09 января 2004

Дата начала действия: 01 февраля 2004
Информация о данном документе содержится в профессиональных справочных системах «Кодекс» и «Техэксперт»
Узнать больше о системах