МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
N 98/253

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СИСТЕМ НА ОСНОВЕ ПОЛИМОРФИЗМА ДЛИНЫ АМПЛИФИЦИРОВАННЫХ ФРАГМЕНТОВ (ПДАФ) ДНК В СУДЕБНО-МЕДИЦИНСКОЙ ЭКСПЕРТИЗЕ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЛИЧНОСТИ И УСТАНОВЛЕНИЯ РОДСТВА

УТВЕРЖДАЮ

Заместитель Министра здравоохранения Российской Федерации А.И.Вялков 19 января 1999 года

СОГЛАСОВАНО

Руководитель Департамента научно-исследовательских и образовательных медицинских учреждений В.И.Сергиенко 18 января 1999 года

Руководитель Департамента организации медицинской помощи населению А.А.Карпеев 11 января 1999 года

Методические указания посвящены регламентированию в рамках экспертного подхода методических и аналитических процедур, сопряженных с анализом полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) в аллельных профилях гипервариабельных локусов хромосомной ДНК человека, а также общей методологии использования индивидуализирующих ПДАФ-систем при решении задач судебно-медицинской экспертизы. Обобщен и проанализирован накопленный практический опыт, касающийся производства судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека, и в частности - методов идентификации личности и определения биологического родства, основанных на использовании феномена ПДАФ.

Настоящие Методические указания касаются общих принципов экспертного использования молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе феномена ПДАФ. Для более детальной проработки конкретных вопросов практического применения метода следует обратиться к другим нормативным, инструктивным и методическим документам, регламентирующим производство экспертиз в Российской Федерации, в частности, к "Правилам производства судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998), "Стандартным операционным процедурам" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998) и др.

Методические указания подготовлены зав. отделом судебно-медицинских генетических научных и экспертных исследований Республиканского центра судебно-медицинской экспертизы доктором биологических наук Ивановым П.Л.

Введение

Существует несколько базовых технологий молекулярно-генетического (геномного) идентификационного анализа, применяемых в судебно-медицинской экспертной практике. Общим для них является исследование особых, так называемых гипервариабельных участков геномной ДНК человека, которые строго специфичны для каждого индивидуума и потому могут служить индивидуализирующими личность признаками.

Вариант молекулярно-генетического идентификационного анализа, в основе которого лежит феномен полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК, является одним из наиболее перспективных в плане судебно-медицинского исследования вещественных доказательств. Он отличается высокой дифференцирующей способностью - благодаря использованию в качестве маркерных (диагностических) элементов высокополиморфных генетических локусов мини- и микросателлитной природы, а также чрезвычайно высокой чувствительностью - благодаря применению процесса энзиматической амплификации молекул ДНК, известному как полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Феномен ПДАФ проявляется в том, что в случае ПЦР-амплификации гипервариабельных мини- и микросателлитных генетических матриц (локусов), присутствующих в геноме каждого человека, в ходе реакции образуются фрагменты ДНК, которые у разных людей имеют разную длину - и потому оказываются индивидуально специфичными. Эти полиморфные по длине фрагменты, по сути представляющие разные аллельные варианты полиморфных локусов геномной ДНК, становятся доступными для сравнительного анализа в качестве индивидуализирующих личность признаков. Важно отметить, что в ряду поколений каждый вариант ПДАФ наследуется как простой менделевский кодоминантный признак. Все это создает прекрасные предпосылки для решения экспертных задач, связанных как с индивидуализацией и идентификацией, так и с установлением биологических родственных связей данного индивидуума с другими лицами (например, установление фактов отцовства или материнства).

ПДАФ-типирование ДНК является одним из наиболее доказательных методов анализа биологического материала при производстве судебно-медицинской идентификационной экспертизы. В то же время, следует подчеркнуть, что экспертные исследования биологических объектов с использованием индивидуализирующих систем ПДАФ-типа предъявляют очень высокие требования как к техническому обеспечению анализа, так и к степени корректности экспериментальных процедур и интерпретационных построений. Наряду с бесспорными преимуществами по сравнению с традиционными методами, экспертное применение анализа ПДАФ в судебно-медицинской практике сопряжено с целым рядом осложняющих моментов. Технология анализа включает многостадийные операции и многопараметрические процессы, которые таят в себе опасность различного рода артефактов. Интерпретация получаемых в ходе исследования данных часто достаточно сложна и требует детального анализа с позиции молекулярной биологии и популяционной генетики. Учитывая же характерное для данного вида экспертизы высокое доказательственное значение выводов, возможная неадекватность экспериментальных процедур и неправильное истолкование результата чреваты серьезными экспертными и, как результат, судебно-следственными ошибками.

Из всего сказанного очевидно, что для обеспечения надлежащего уровня надежности и доказательности необходима строгая методическая регламентация судебно-медицинских экспертиз вещественных доказательств, проводимых с помощью применения методов молекулярно-генетической индивидуализации человека. В рамках этой задачи в настоящих Методических указаниях изложены общие принципы экспертного использования молекулярно-генетических индивидуализирующих систем на основе феномена ПДАФ для целей идентификации личности и разрешения вопросов спорного происхождения детей. Рассмотрены принципиальные вопросы, касающиеся специфики лабораторных процедур и интерпретации экспертных данных, а также методические приемы, призванные повысить надежность анализа.

Описание метода

1. Формула метода

Предложен метод судебно-медицинской экспертизы (исследования) вещественных доказательств биологической природы, основанный на молекулярно-генетической индивидуализации человека. Принцип метода заключается в использовании индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) хромосомной ДНК.

В общем виде метод предусматривает выделение из исследуемых объектов хромосомной ДНК, энзиматическую амплификацию с помощью ПЦР мини- и микросателлитных локусов этой ДНК, которые в силу своей природы обладают свойством индивидуальной специфичности, и сопоставление полученных индивидуальных картин распределения по длине амплифицированных фрагментов ДНК (так называемых амплификационных профилей) с целью их отождествления или выявления сходства и различий и установления на этом основании определенных фактов в плане судебно-медицинской идентификации личности и определения биологического родства.

2. Материально-техническое обеспечение метода

2.1. Требования к помещениям

Судебно-медицинская экспертиза вещественных доказательств с помощью применения индивидуализирующих систем ПДАФ-типа должна проводиться только в специализированной лаборатории бюро судебно-медицинской экспертизы, удовлетворяющей требованиям "Положения о лаборатории молекулярно-генетических исследований бюро судебно-медицинской экспертизы" (приложение к Приказу Минздрава РФ N 131 от 22.04.98 "О мерах по совершенствованию судебно-медицинской службы в Российской Федерации").

Главным требованием является обеспечение и строгое соблюдение принципа компартментализации основных стадий производственного процесса. Это означает, что в лаборатории должны быть выделены территориально автономные операционные зоны (компартменты), каждая из которых предназначена для выполнения строго определенного круга операций. Каждая зона должна быть укомплектована спецодеждой, лабораторным и офисным оборудованием, посудой, которые предназначены для использования только в границах данной зоны. Таких зон минимум три:

а) лабораторная зона общего назначения: помещения для хранения и препарирования вещественных доказательств, забора крови, выделения и очистки ДНК, мойки и стерилизации посуды; к этой зоне относятся кабинеты экспертов, лаборантские и санитарские помещения, компьютерный зал для обработки данных и оформления документов, аппаратные;

б) чистая зона ПЦР: стерильные, оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с приточно-нагнетательной вентиляцией - для приготовления реагентов, компонентов реакционных смесей, для пробоподготовки и постановки ПЦР;

в) зона для анализа продуктов амплификации: оборудованные УФ-облучателями боксированные помещения с вытяжной вентиляцией - для проведения электрофореза ДНК, окрашивания гелей и документирования электрофореграмм.

Компартментализация рабочего процесса, связанного с применением ПЦР, служит абсолютно необходимой мерой предосторожности, которая позволяет свести к минимуму риск случайных загрязнений компонентов реакции ранее амплифицированными продуктами или молекулами ДНК из посторонних источников. Способность ПЦР амплифицировать единичные молекулы ДНК означает, что опасность представляют даже самые незначительные, следовые количества ДНК-контаминантов, которые могут вовлекаться в реакцию как матричные молекулы. Это приводит к искажению результатов исследования.

2.2. Необходимое оборудование

В соответствии с процедурой метода на первом этапе осуществляется выделение из исследуемых объектов геномной ДНК, ее очистка, определение концентрации и хранение. Для этого необходимо типовое лабораторное оборудование для молекулярной биологии (в том числе: вытяжной шкаф, мини- и микроцентрифуга, суховоздушный и водяной термостаты, рн-метр, аквадистиллятор-деионизатор, спектрофотометр, аналитические весы, микропипетки-дозаторы, лабораторная посуда, холодильник/морозильник).

Постановка ПЦР требует наличия стерильного шкафа-бокса с ультрафиолетовым облучателем, а также термоциклера (ДНК-амплификатора). Эти позиции выпускаются серийно отечественными и зарубежными производителями.

На этапе электрофоретического фракционирования ДНК необходимы стандартные аппараты для электрофореза в гелях агарозы и полиакриламида (соответственно, горизонтальные и вертикальные), микроволновая печь, стандартные источники тока для электрофореза - низковольтный (300 в/250 mA) и высоковольтный (1000 в/300 mA), УФ-трансиллюминатор, снабженный системой документирования изображения (напр. фото- или видеокамерой) или/и прибор для вакуумной сушки гелей.

Для анализа результатов исследования и обработки экспертных данных требуется набор стандартной офисной оргтехники (компьютер с периферийными устройствами: принтер, сканер и проч.).

3. Технология использования метода

Технологическая схема выполнения экспертизы вещественных доказательств с использованием ПДАФ-систем включает следующие этапы:

а) получение препаратов хромосомной ДНК из объектов исследования;

б) энзиматическая ПЦР-амплификация на матрице этой ДНК специфических участков, обладающих свойством ПДАФ с целью их последующего генотипирования (определения геномных вариантов);

в) фрагментный анализ: фракционирование с помощью гель-электрофореза продуктов амплификации, сопоставление амплификационных профилей, определение молекулярных размеров фрагментов и их генотипирование;

г) интерпретация результатов: раздельная оценка выявленных геномных признаков и определение их индивидуализирующего значения, сопоставление и оценка различия и совпадения комплекса признаков, анализ всей совокупности экспертных данных с целью разрешения вопросов, поставленных перед экспертизой.

3.1. Получение препаратов ДНК

Предметом судебно-медицинских молекулярно-генетических экспертных исследований являются следы и иные вещественные доказательства по делу - объекты биологического происхождения от трупов и живых лиц. Хромосомная ДНК содержится во всех ядерных клетках организма, поэтому для экспертного исследования в принципе пригодны любые биологические субстраты, в которых сохранились хотя бы единичные ядерные клетки или остатки их ядерного материала: мягкие ткани, жидкая кровь и выделения, высохшие следы крови и выделений, зубы и волосы человека, отчлененные части тела и фрагменты частей тела от неопознанных и расчлененных трупов, фрагменты скелетированных трупов, отдельные кости, костные фрагменты и др. При этом важно подчеркнуть, что во всех клетках одного организма ДНК одинакова. Это позволяет проводить отождествление объектов на основании сравнительного ПДАФ-анализа биологических образцов разного тканевого происхождения.

С точки зрения экспертного использования, среди множества известных методик выделения и очистки ДНК наибольшее значение имеет классическая фенол-хлороформная экстракция, которая универсальна, обладает хорошей воспроизводимостью и способна обеспечить высокую степень чистоты ДНК; полученные этим методом препараты стабильны и могут храниться при +4°С в течение нескольких лет. Поэтому методикам выделения ДНК, основанным на органической экстракции, следует отдать предпочтение.

В общем случае, это многоэтапные процедуры, которые предусматривают разрушение (лизис) клеточных структур и диссоциацию хромосомных нуклеопротеидных комплексов с помощью применения детергентов, протеазную обработку лизата, экстрагирование белков органическими растворителями, отделение водной фазы, содержащей ДНК, и концентрирование и очистку ДНК путем спиртовой преципитации или ультрамикрофильтрации.

Существуют также методики, которые без применения органических растворителей позволяют получать пригодные для анализа в ПЦР препараты ДНК. Большинство из них являются вариантами вышеприведенной схемы, но позволяют экономить время и не прибегать к трудоемкой процедуре фенольной экстракции. Однако эти процедуры применимы лишь для некоторых видов объектов. Наиболее распространенным универсальным неорганическим методом, пригодным для экспертного применения, является метод с использованием хелатирующего реагента "Килекс" (Chelex(R) 100). Это экспресс-метод, который вообще не предполагает выделения ДНК в очищенном виде; получаемый препарат по сути представляет клеточный лизат, который содержит все исходные компоненты, только в инактивированной форме. Этот метод прост и не требует много времени. Нужно однако учитывать, что его надежность, а также качество и стабильность "килексных" препаратов в целом заметно ниже, чем фенол-хлороформных экстрактов.

Очень важный в экспертной практике частный случай - это получение ДНК из спермы и смешанных следов, содержащих сперму. Особенность здесь в том, что хроматин сперматозоидов имеет принципиальное отличие от хроматина соматических клеток - его структура дополнительно стабилизирована дисульфидными связями. Поэтому применяемый по стандартной процедуре выделения ДНК протеолиз в случае спермального хроматина малоэффективен и идет очень медленно, а используемые для диссоциации нуклеопротеинов детергенты практически не оказывают на него солюбилизирующего действия. В результате выход спермальной ДНК оказывается практически нулевым. Для преодоления этой трудности при выделении ДНК из спермы в клеточный лизат вводят дополнительно реагенты-тиовосстановители, например дитиотрейтол или 2-меркаптоэтанол, которые разрушают дисульфидные белковые сшивки. Это позволяет продолжить процесс по стандартной схеме.

На использовании описанной особенности спермального хроматина основан общепринятый метод селективного выделения ДНК сперматозоидов из смешанных следов, содержащих сперму. Это двухэтапная процедура, получившая название дифференциального лизиса клеток. Суть ее заключается в том, что при выделении ДНК из смеси сперматозоидов и соматических клеток на первом этапе, представляющем собой стандартный протеазно-детергентный лизис, солюбилизируется только хроматин соматических клеток. Его раствор отделяют центрифугированием от остающегося структурированным (и потому нерастворимым) спермального хроматина и используют для экстрагирования соматической ДНК. Отделенный же спермальный хроматин подвергают второму литическому циклу, но уже с добавлением реагентов-тиовосстановителей, и уже потом из получившегося лизата экстрагируют спермальную ДНК.

Следует особо подчеркнуть, что при проведении судебно-медицинского исследования следов, содержащих сперму, для дифференцирования присутствующих в смеси генетического материала мужчины - донора спермы и ДНК из других возможных источников (например, эпителиальных клеток и клеток крови потерпевших при изнасиловании), в обязательном порядке должны применяться только такие методики, которые включают двухэтапный дифференциальный лизис клеток с использованием на втором этапе реагентов-тиовосстановителей.

Типовые варианты методик получения препаратов ДНК из объектов экспертизы - как с использованием органической экстракции, так и в виде "килексных" лизатов, приведены в сборнике "Стандартные операционные процедуры" (РЦСМЭ МЗ РФ, 1998 г.).

3.2. ПЦР-амплификация полиморфных локусов на матрице геномной ДНК

При постановке ПЦР геномную ДНК, обычно в количестве 2-200 нг, вводят в реакционную смесь, содержащую все необходимые компоненты для работы фермента - термостабильной ДНК-полимеразы (обычно Taq полимеразы в количестве 1-3 е.а.). Там хромосомная ДНК будет служить субстратом-матрицей для амплификации нужного локуса. Специфическим компонентом реакции и амплификационной индивидуализирующей системы в целом являются олигонуклеотидные (15-30 звеньев) праймеры - именно они определяют, какой генетический локус будет избирательно нарабатываться в ходе реакции. Праймеры ориентированы таким образом, что синтез новых полинуклеотидных цепей с помощью ДНК-полимеразы осуществляется только между ними, удваивая в каждом цикле количество копий этого участка ДНК. Для проведения полимеразной цепной реакции, кроме исходного препарата ДНК, праймеров (в концентрации 0,1-1 мкМ), Taq полимеразы, нужны еще так называемые предшественники ДНК - дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дезоксинуклеотиды) в концентрации 200 мкМ и солевой буферный раствор. Эти компоненты смешивают в реакционной пробирке в микрообъеме (обычно 25-100 мкл) и помещают в специальный прибор - программируемый термоциклер (ДНК-амплификатор), который обеспечивает необходимый температурный профиль реакции: она претерпевает 25-35 циклов нагрева и охлаждения в интервале температур от 50 до 95°С.