МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИСТАМИНА В РЫБЕ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ГИСТАМИН (RIDASCREEN® HISTAMIN)
(производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)

     1. Область применения методики

Методика предназначена для количественного определения гистамина в рыбе (скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и др.) с помощью тест-системы для иммунно-ферментного анализа RIDASCREEN® Histamin*.

________________

* RIDASCREEN® является зарегистрированным товарным знаком фирмы R-Biopharm, Германия

     2. Краткое описание методики

     3. Общие положения

Гистамин является одним из биогенных аминов, образующихся в рыбе при декарбоксилировании аминокислот, в том числе, в результате деятельности бактерий. Поскольку биогенные амины принадлежат к веществам, участвующим в обмене веществ высших животных, они легко метаболизируются и поэтому обычно хорошо переносятся человеком, если их концентрация в пище находится в пределах допустимого уровня.

При бактериальном загрязнении рыбы повышение уровня содержания биогенных аминов, в частности гистамина, может причинить вред здоровью потребителя. При содержании гистамина выше обычного уровня естественный механизм детоксификации аминов за счет деятельности ферментов - аминооксидаз (гистаминазы) уже не справляется. Повышенное поступление гистамина может вызвать так называемую "гистаминовую" мигрень (синдром Хортона), головную боль (невралгия Харриса, характеризующаяся болью в области глаз, лба, височной части головы, слезотечением, воспалением слизистой носа) и другие симптомы, включая тошноту, понос, испарину, повышенное выделение желудочного сока, учащение сердцебиения и снижение диастолического (нижнего) кровяного давления.

Бактерии Enterobacteriaceae, в частности колиформы, обладают высокой декарбоксилизующей активностью, причем даже при стерилизации рыбы наработка гистамина не прекращается за счет деятельности активных ферментов. Продуктами риска является в первую очередь рыба богатая гистидином, в частности скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и некоторые другие продукты, например, сыр, мясо, шампанское, вино, пиво и кислая капуста.

Содержание гистамина в пище нормируется во всех развитых странах и является важнейшим показателем свежести рыбы. Так, например, согласно СанПиН 2.3.2.560-96 Российской Федерации содержание гистамина в рыбе не должно превышать 100 мг/кг, в Соединенных Штатах норма гистамина составляет 50 мг/кг (производители рыбных консервов контролируют сырье по норме 5-15 мг/кг гистамина).

Традиционный фотоколориметрический метод контроля гистамина в рыбе трудоемок, занимает длительное время и характеризуется малой производительностью.

В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммунно-ферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС*).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

     4. Нормативные ссылки

Использованы ссылки на следующие нормативные документы:

ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.

ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования.

ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты.

ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.

ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.

ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.

ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести.

ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.

ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества.

ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.

ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.

ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.

ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.

ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.

     5. Сущность метода

В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Histamin, сенсибилизирован гистамином. Анализ выполняется следующим образом.

Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к гистамину дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном растворе) и молекулы гистамина, адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с внесенными антителами к гистамину.

После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий вторичные антитела коньюгированные с пероксидазой, которые во время второй инкубации связываются комплексом гистамин - антитело на поверхности планшета. Несвязанные молекулы коньюгата удаляются при очередной промывке.

В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы коньюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.

Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых образцах.

     6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций

6.1. Предел обнаружения гистамина составляет:

2.5 мг/кг при навеске образца 2 г

6.2. Диапазон определяемых концентраций гистамина составляет: