Приложение N 2
к приказу Минздрава СССР
от 13 марта 1975 г. N 250

     

Методические указания по применению унифицированных методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

1. Микробиологические исследования

1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Критерии чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Успех химиотерапии во многом зависит от правильного выбора соответствующего лечебного препарата, для чего крайне важно располагать сведениями о чувствительности возбудителя болезни к избираемому для лечения препарату.

В клинической практике чувствительными к препарату считаются те микроорганизмы, на которые препарат в концентрации, достигаемой в очаге инфекции, оказывает бактериостатическое или бактерицидное действие. В соответствии с этим критерии чувствительности микроорганизмов зависят от концентрации лечебного препарата в очаге инфекции, величины максимальной терапевтической дозы препарата, его фармакокинетики и токсичности.

Мерой чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам при постановке лабораторного теста является минимальная концентрация препарата, ингибирующая рост возбудителя заболевания при стандартных условиях постановки опыта. Деление микроорганизмов на устойчивые и чувствительные производится на основании соотношения минимальной ингибирующей рост микроба концентрации препарата, определенной в лабораторных условиях, концентрации этого же препарата, создаваемой в очаге инфекции при введении терапевтических доз. При соотношении

можно говорить о чувствительности микроорганизма к данному химиотерапевтическому препарату.

Для клинической практики целесообразно делить микроорганизмы по степени чувствительности к химиотерапевтическим препаратам условно на 4 группы:

1-я группа - "чувствительных" микроорганизмов, когда обычно применяемые дозы препарата являются достаточными для достижения лечебного эффекта при общих заболеваниях;

2-я группа - "средне чувствительных" микроорганизмов, когда только повышенные дозы препарата могут обеспечить лечебный эффект при общих заболеваниях;

3-я группа - "умеренно устойчивых" микроорганизмов, когда лечебный эффект может быть достигнут только при локализации инфекционного очага в месте, где препарат концентрируется, или если препарат может быть введен непосредственно в очаг инфекции;

4-я группа - "устойчивых" микроорганизмов, когда нельзя рассчитывать на лечебный эффект.

Особенно важно определять чувствительность возбудителя заболевания к химиотерапевтическим препаратам:

- при процессах, вызванных микроорганизмами часто устойчивыми к лечебным препаратам;

- при затяжных инфекциях, когда сопротивляемость макроорганизма нарушена и выбор наиболее активного препарата играет особо важную роль;

- при применении препаратов, к которым во время лечения быстро развивается устойчивость (стрептомицин, рифампицин и некоторые другие.

В настоящее время предложены критерии чувствительности микроорганизмов только для некоторых антибиотиков (табл.1). Для других химиотерапевтических препаратов критерии чувствительности разрабатываются.

Таблица 1

Классификация микроорганизмов по степени чувствительности к антибиотикам (МИК в мкг/мл или ед/мл)

Примечания: +) - критерии чувствительности относятся ко всем лекарственным формам указанного антибиотика.

х - группа не установлена.

Взятие материала для выделения возбудителя заболевания и определения его чувствительности к лекарственным препаратам

Важным условием соответствия результатов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам и клинической эффективности последних является исследование чувствительности чистых культур истинных возбудителей инфекции, а не сопутствующей им микрофлоры. Поэтому при взятии материала для исследования следует соблюдать следующие правила:

1. Материал должен быть получен до начала антибактериальной терапии или через такой период после введения антибактериального препарата, который необходим для его элиминации из организма больного.

2. Материал для посева при определении чувствительности следует брать непосредственно из очага инфекции с соблюдением правил асептики (стерильными инструментами, в стерильную посуду и т.п.).

3. В тех случаях, когда взятие материала непосредственно из очага инфекции невозможно, но он сообщается с внешней средой, можно производить исследование соответствующего отделяемого: мочи при пиелонефрите, мокроты при воспалительных процессах в легких, отделяемого цервикального канала при сальпингоофоритах и т.д. Перед сбором материала для посева следует провести предварительную обработку антисептическими растворами доступных для этого полостей или поверхностей человеческого организма, по которым проходит исследуемый материал.

Например, при сборе мокроты больной должен утром до еды почистить зубы, прополоскать рот слабым раствором антисептика и затем откашлять мокроту в стерильную карманную плевательницу или прокипяченную баночку с крышкой. При этом больному надо объяснить, что он не должен собирать носоглоточную слизь и слюну, а должен стараться собрать только отделяемое дыхательных путей. Если мокрота отделяется плохо, больному следует накануне назначить отхаркивающее.

Мочу для посева после тщательного туалета наружных половых органов 0,5% раствором марганцевокислого калия берут стерильно катетером или получают ее при естественном мочеиспускании, отбросив первую небольшую порцию ("первую струю").

4. Посев материала, взятого у больного, производят на соответствующий набор питательных сред, необходимых для выделения чистых культур различных видов микроорганизмов. В смешанной культуре производить определение чувствительности к антибактериальным препаратам не следует, так как скорость роста различных микроорганизмов, присутствующих в ассоциациях, неодинакова и при подобном методе исследования определяется чувствительность к антибактериальным препаратам наиболее быстро растущих видов, не всегда являющихся возбудителями заболеваний. Кроме того, при определении чувствительности бактерий в смешанных культурах можно получить ложные результаты за счет микробного антагонизма, когда рост одной культуры может быть подавлен не антибактериальным действием препарата, а вследствие антагонистического влияния другой культуры.

5. Если в исследуемом материале находится несколько видов условнопатогенных микроорганизмов, необходимо выяснить, какой из них является ведущим в данном патологическом процессе.

Ориентировочные данные можно получить при использовании метода количественного учета обсемененности материала, например, определение степени бактериурии при пиелонефритах - преобладание в моче одного вида микроорганизмов может свидетельствовать о его этиологической роли в данном процессе.

С этой же целью проводится бактериоскопическое исследование материала, нацеливающее бактериолога на определенную флору, которую он должен будет получать, применяя селективные и элективные среды. Например, в мокроте больного пневмонией при бактериоскопии обнаружены в большом количестве пневмококки и в значительно меньшем - стрептококки и стафилококки. При первичном посеве мокроты пневмококки могут не вырасти совсем или вырасти в относительно небольшом количестве. Однако, бактериолог, ориентированный по мазку из посевного материала, приложит усилия для выделения и определения чувствительности к антибактериальным препаратам именно пневмококков.

6. Если выяснение истинного возбудителя не удается, или патологический процесс вызван микробной ассоциацией, исследуется раздельно чувствительность к антибактериальным препаратам всех членов, выделенных в чистой культуре.

7. В некоторых случаях, например, при раневой гнойной инфекции или термических осложненных ожогах, когда процесс вызывается ассоциацией микроорганизмов, практикуется определение чувствительности сразу всей ассоциации. Однако, эти данные надо рассматривать как сугубо ориентировочные, которые необходимо дополнить исследованием чувствительности раздельно у каждого из членов ассоциации.

8. В отдельных случаях определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам может проводиться при первичном посеве материала на питательные среды. Это возможно тогда, когда возбудитель находится в исследуемом материале и в достаточно большом количестве (например, в гное из закрытых очагов).

Выбор методов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам

Определение чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам в настоящее время может проводиться методом диффузии в агар с применением бумажных дисков или методом разведений, представленным двумя модификациями - метод разведений в плотной питательной среде и метод разведений в жидкой питательной среде. Применяются также и ускоренные методы определения чувствительности, среди которых есть как методы диффузии, так и методы разведений.

Выбор метода зависит от цели исследования и возможностей лаборатории, выполняющей исследования.

Метод диффузии в агар с применением дисков следует расценивать как метод качественный. Благодаря простоте, скорости и легкости исполнения он является основным при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам практическими лабораториями.

Метод разведений - наиболее точный количественный метод. Он должен применяться в научно-исследовательской работе, при проведении международных исследований, а также в особенно важных случаях в лабораториях областных, краевых и республиканских санэпидстанций и в некоторых лабораториях лечебно-профилактических учреждений.

Методом разведений в плотной питательной среде рациональнее пользоваться при необходимости исследовать одновременно большое количество культур, так как на чашку с плотной средой можно посеять одновременно несколько штаммов. Необходимо отметить также большую точность метода разведений в плотной среде, при котором определяется чувствительность к препарату большинства вариантов микробной популяции, в то время как при использовании жидкой среды определяется чувствительность наиболее устойчивых вариантов.

Ускоренные методы служат дополнением к основным вышеназванным методам.

Определение чувствительности микроорганизмов к сульфамидам затруднено тем, что большинство питательных сред, применяемых для определения лекарственной устойчивости микроорганизмов, для этих препаратов не годится: эти среды содержат значительное количество метаболитов, которые являются антагонистами сульфамидов (РАВА, фолиевая кислота и т.п.). Поэтому определение чувствительности микробов к сульфамидам производят методом разведений на специальных средах. Для определения чувствительности к сульфамидам энтеробактерий рекомендуется среда Биргера и Зац, а бактерий кокковой группы - среда Ланди, которые могут применяться как жидкими, так и агаризированными. В связи с существованием перекрестной устойчивости микроорганизмов к большинству сульфамидов при определении чувствительности возбудителей к этим препаратам достаточно проверить чувствительность к одному какому-либо сульфамиду - например, норсульфазолу.

Для облегчения сравнения полученных результатов и их правильной оценки необходимо при определении чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам любым методом обеспечить наиболее стандартные условия постановки опыта.

1.1.1. Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением бумажных дисков

Принцип. На поверхность питательного агара в чашках Петри, засеянного испытуемыми микробами, наносят бумажные диски, пропитанные антибиотиками, и чашки инкубируют при 37°С. Наличие зоны задержки роста микробов вокруг дисков свидетельствует о чувствительности возбудителя к препарату, отсутствие зоны задержки роста - об устойчивости.

Компоненты.

1. Диски. Для исследования могут быть использованы только стандартные заводские диски. Во флаконах с дисками, пропитанными нестойкими к влаге антибиотиками, находится силикагель, который является хорошим влагоуловителем и показателем влажности во флаконе (при увлажнении силикагель меняет свою окраску с синей на розовую). Диски из флаконов, в которых силикагель окрашен в коричневый или розовый цвет, не используются. Диски хранят в сухом темном месте при температуре не выше 20°С. После вскрытия флакона дисками можно пользоваться не более месяца.

2. Питательные среды.

а) Среда на переваре Хоттингера с содержанием 120-140 мг% аминного азота, 1-2% агара, pH 7,2-7,4.

б) Казеиново-дрожжевая среда с таким же содержанием аминного азота и агара и значением pH.

в) Мясо-пептонная среда с таким же содержанием агара и pH.

В случае необходимости в среду может быть добавлено 5% крови или сыворотки, что отрицательного влияния на результаты анализа не оказывает.

Ход определения. В стерильные чашки Петри диаметром 100 мм, расположенные на горизонтальной поверхности, наливают 20 мл расплавленного питательного агара. Перед посевом поверхность среды должна быть подсушена для того, чтобы посевной материал мог легко всасываться. В качестве посевного материала может быть использована суточная бульонная культура (при интенсивном росте допускается использование 4-5-часовой культуры, при медленном росте - 2-3-суточной культуры) или 1-млрд-суспензии, приготовленной с агаровой культуры. 1 мл бактериальной взвеси наносится на поверхность агара и равномерно распределяется путем покачивания чашки с последующим отсасыванием избытка жидкости пипеткой.

В тех случаях, когда допускается постановка теста с испытуемым материалом (гной, раневое отделяемое и др.), последний наносят на поверхность питательного агара и равномерно растирают по поверхности среды стерильным шпателем. Одновременно исследуемый материал засевают для выделения чистой культуры и последующей постановки теста с чистой культурой. При монокультуре исследование можно не повторять.

Чашки подсушивают в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Затем на поверхность засеянной среды пинцетом накладывают диски, пропитанные различными антибиотиками. В каждой чашке может быть испытано действие нескольких антибиотиков (до 5-6). Диски накладывают на поверхность агара плотно для тесного контакта со средой, следя за тем, чтобы не были положены 2 сцепленных между собой диска. Диски размещают на равном расстоянии один от другого и примерно на 2 см от края чашки. Чашки ставят в термостат перевернутыми кверху дном или вкладывают под крышку чашки кружок фильтровальной бумаги, чтобы избежать размывания газона конденсационной водой, и инкубируют при 37°С в течение 18-ти часов. Если исследуемый вид микроорганизмов растет медленно, инкубацию продлевают до 48-72 часов или более, в зависимости от появления роста в контроле.