МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
по лабораторному исследованию спермы производителей, а также препаратов и инструментов, применяемых при искусственном осеменении животных, на бактериальную загрязненность
(утверждены Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 17 июля 1969 г.)
1. В целях ветеринарного контроля за качеством спермы производителей сельскохозяйственных животных проводят ветеринарно-санитарную оценку спермы, препаратов и инструментов, применяемых при искусственном осеменении маток. При этом в ветеринарных лабораториях проводят следующие бактериологические исследования:
а) определение общего количества микробов в сперме, смывах из препуциальной полости, на инструментах и приборах;
б) исследование сред и препаратов на стерильность;
в) определение их коли-титра или коли-индекса.
Взятие и доставка проб. 2. При взятии проб следует соблюдать условия, позволяющие предупредить загрязнение их посторонней микрофлорой. В этих целях пробы спермы и смывы из препуциального мешка производителя берут только после соответствующей подготовки самого производителя, а также манекена, инструментария, используемого при взятии спермы, и манежа, где эту работу проводят. Чтобы число микроорганизмов не увеличивалось за счет их размножения, взятые пробы для исследования хранят при температуре 2-4°С.
Пробу спермы получают от производителей только при помощи асептически подготовленной искусственной вагины. Из спермоприемника пробу берут в стерильной камере (УНБК-1) или стерильной комнате (боксе) при помощи стерильной стеклянной пипетки из средней части эякулята при слегка приподнятой крышке спермоприемника, переносят ее в сухой стерильный флакон (пробирку, колбочку) и закрывают пробкой над пламенем спиртовки. Желательны склянки с притертой пробкой. Можно также использовать и резиновые пробки, обернутые пергаментной бумагой и простерилизованные вместе с флаконами.
3. Для получения смыва в полость препуция вводят при помощи стерильного шприца и резиновой трубки 10 мл стерильного физиологического (0,9%) раствора NaCl, правой рукой зажимают кожу у входа в препуций вместе с резиновой трубкой, а левой - проводят легкий массаж в течение 1-2 минут, перемещая раствор в полости. После этого пробу смыва насасывают поршнем шприца через резиновую трубку и переносят ее в стерильные склянки.
4. Для исследования на стерильность инструментов, полистироловых пипеток и т.п. смыв с них берут в настольной стерильной камере или стерильной комнате (боксе). При взятии смыва с пипеток наружную поверхность полиэтиленового мешочка, в котором упакованы пипетки, обрабатывают тампоном, смоченным 70° спиртом. Стерильными ножницами надрезают один угол полиэтиленового мешочка и достают стерильным пинцетом пипетку. Смыв делают с внутренней и наружной поверхности пипетки.
Для взятия смыва с внутренней стороны пипетки на ее конец надевают стерильный полиэтиленовый или резиновый баллончик, с помощью которого через ту же пипетку набирают 1 мл стерильного физиологического раствора хлористого натрия и промывают пипетку 3-5 раз (раствор хлористого натрия для этой цели расфасовывают в пробирки по 1 мл и стерилизуют заранее).
Для получения смыва с наружной поверхности пипетки (инструмента) стерильным пинцетом берут марлевый тампон диаметром 7-8 см, смачивают его стерильным физиологическим раствором хлористого натрия и тщательно протирают наружную поверхность пипетки, удерживая ее пинцетом. После этого тампон помещают в чашку с МПА (мясопептонным агаром) на 3-5 минут (тампон можно оставлять в чашке до конца инкубации) и инкубируют при температуре 37-37,5° в течение 24 часов.
Если смыв с поверхности инструментов приходится брать непосредственно в рабочих комнатах станций или пунктов искусственного осеменения, то заготавливают специально смонтированные пробирки. Для этого на конец деревянной палочки или металлической проволоки, предварительно пропущенной через ватно-марлевую пробку, фиксируют марлевый тампон диаметром 7-8 см. Пробками с тампонами закрывают пробирки и стерилизуют их. В день получения смыва в каждую пробирку с тампоном наливают по 1-2 мл стерильного физиологического раствора хлорида натрия так, чтобы марлевый тампон находился над уровнем жидкости. Перед взятием смыва пробирки наклоняют и увлажняют тампон. Затем тампоном быстро протирают поверхность инструмента и помещают в ту же пробирку.
Для получения смыва с внутренней поверхности искусственной вагины к последней присоединяют с обоих концов стерильные спермоприемники. Один конец вагины приоткрывают и вливают 5 мл физиологического раствора. Легкими движениями вагину вращают и слегка встряхивают. Смыв с камеры искусственной вагины собирают в спермоприемник, переносят в стерильную пробирку и направляют для исследования.
5. Пробы для исследования направляют в лабораторию в объеме: неразбавленной спермы - не менее 1 мл; вазелина, химреактивов, смыва, сред и т.п. - 5-10 мл или граммов. На пробирки (флаконы) наклеивают этикетки с указанием номера пробы и доставляют в лабораторию в термосе или ящике. Если время транспортировки проб до лаборатории будет превышать 2 часа, то в термос необходимо положить лед, на который кладут флаконы, обернутые ватой (температура 2-4°). С момента взятия проб до начала исследования допускается их хранение не более 6 часов при температуре 2-4° и не более двух часов при более высокой температуре. Замороженную сперму транспортируют в термосе с жидким азотом.
6. К каждой пробе, направляемой в лабораторию, прилагают сопроводительный документ и опись (см. приложение). В сопроводительном документе указывают: 1) наименование учреждения, которое отправляет пробы; 2) количество направляемых проб; 3) год, месяц, число и час взятия спермы; 4) какими методами и в каких условиях взяты пробы; 5) сведения об использовании производителя и его ветеринарно-санитарной обработки; 6) для какой цели направляются пробы; 7) характер упаковки и способ транспортировки проб; 8) опись проб; 9) должность и адрес лица, взявшего пробу, и его подпись.
Опись проб составляют в 3 экземплярах.
Определение общего числа бактерий. 7. Для определения общего числа бактерий в 1 мл или 1 г пробы применяют 1,5-2%-ный МПА с добавлением 1% глюкозы (на 1 л мясопептонного бульона добавляют 15-20 г агара, 10 г глюкозы), рН среды устанавливают 7-7,2, стерилизуют обычным методом. Перед стерилизацией агар желательно профильтровать.
Перед посевом пробу спермы, смыва или среды тщательно перемешивают встряхиванием, не смачивая пробки. Стерильными градуированными пипетками делают посев в бактериологические чашки. В зависимости от степени ожидаемого загрязнения высевают 1,0; 0,1; 0,01; 0,001; 0,0001 мл (г) пробы с таким расчетом, чтобы в чашках на МПА вырастало не очень большое число колоний, что удобно для подсчета.
При высеве небольшого объема пробы делают последовательные разведения. С этой целью в пробирку с 9 мл стерильного физиологического раствора вносят 1,0 мл исследуемого материала и тщательно перемешивают. Получают разведение 1:10 (в 1 мл такого раствора содержится 0,1 мл пробы). Затем из пробирки первого разведения пипеткой переносят 1 мл раствора во вторую пробирку с 9 мл физиологического раствора (второе разведение 1:100; в 1 мл раствора содержится 0,01 мл пробы). Так поступают до получения необходимого разведения.
При разведении можно пользоваться одной пипеткой, но при этом необходимо растворы набирать резиновой грушей или полиэтиленовым баллончиком и тщательно (не менее 3 раз) промывать пипетку раствором из той пробирки, в которую перенесли суспензию. Если эти требования не могут быть выполнены, то для каждого разведения берут новую стерильную пипетку. Следует учитывать, что при приготовлении разведений пользование одной пипеткой в отдельных случаях может привести к завышению показателей вследствие адсорбции микроорганизмов на стенках пипетки. В результате адсорбированные микробы могут попадать в пробирку с гораздо большим разведением.
8. Рекомендуются три метода посева материала:
а) посев на поверхность МПА, заранее разлитого в бактериологические чашки (поверхностный пластинчатый метод);
б) разлив в пустые стерильные бактериологические чашки посевного материала, предварительно смешанного с 10-15 мл расплавленного агара при температуре 45-46° (метод одновременных разливок);
в) высев на поверхность застывшего МПА, предварительно смешанного с 2-3 мл подогретого 0,75-1% агара (двухслойный метод).
9. При исследовании сухих препаратов на стерильность в камере или стерильном боксе отвешивают 1 г пробы на обеззараженных весах. Навеску растворяют в 9 мл стерильной дистиллированной воды и взбалтывают в течение 10-15 минут. После полного растворения пробы делают ряд разведений в зависимости от предполагаемого загрязнения и высевают на среду. При подсчете количества микробных тел в 1 г первую пробирку, в которой растворяли пробу, считают за разведение 1:10.
Материал высевают в объемах не более 1 мл и не менее 0,3 мл стерильной градуированной пипеткой. При использовании чашек с заранее приготовленным агаром их перед посевом выдерживают в термостате 24 часа (проверка на стерильность). Суспензию, нанесенную на МПА, равномерно распределяют по всей поверхности агара стерильным шпателем, который делают из стеклянной палочки или пастеровской пипетки. Распределяют суспензию до полной ее адсорбции агаром. Чашки помещают в термостат и выдерживают при 37-37,5° 24 часа.
