ГОСТ ISO/TS 13136-2016 Микробиология пищевой продукции и кормов для животных. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени для определения патогенных микроорганизмов. Горизонтальный метод определения бактерий Escherichia coli, продуцирующих Шига-токсин, в том числе серогрупп O157, O111, O26, O103 и O145 (с Поправкой)

Приложение D
(справочное)

     
Внутренний контроль амплификации

Три различных внутренних контроля элементов амплификации (lACs) могут быть использованы в ПЦР в режиме реального времени:

- TaqMan® представляет собой внутренний положительный контроль. Это комплект реагентов, включающий в себя все необходимые реагенты (праймеры, Vic™ IAC ДНК-мишень и стоп-раствор). IAC ДНК-мишень требует разбавления в 10 раз, для достижения количества копий примерно для 100 ПЦР-реакции. Размер образующегося ПЦР продукта неизвестен.

_______________

TaqMan и Vic являются торговыми наименованиями продукции, поставляемой Applied Biosystems. Данная информация приведена для удобства пользователей настоящим стандартом и не является рекламой ISO данной продукции. Допускается применение аналогичных продуктов, если доказано, что они обеспечивают получение сопоставимых результатов.

- Использование формулы pUC 19 на основе внутреннего контроля амплификации IAC [27]. Приблизительно 100 копий целевой ДНК (PUC 19) следует использовать в реакции ПЦР. Размер образующегося ПЦР продукта IAC составляет 119 bp.

- Рекомбинантную плазмиду (имеющую название Piac-STEC) можно использовать в конкретных анализах stx с помощью ПЦР в режиме реального времени. Этот элемент IAC содержит следующий ДНК-фрагмент, клонированный в позицию EcoRI плазмиды pUC19:

5'ATTTTTGTTACTGTGACAGCTGAAGCTTTACGTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATAGATGTTGATCTTACATTGAACTGGGGAATT-3' (жирным шрифтом выделены прямой и обратный stx1/stx2 праймеры, связывающие сайты последовательности; подчеркнутая последовательность: IAC-зонд сайт связывания).

IAC может быть усилен генами stx, используя те же праймеры, для stx генов (см. приложение Е), с теми же условиями и в той же ПЦР-пробирке [14]. Он обнаруживает специфическую ДНК в пробе (5' [Red640]-CAAGGCGACAAGGTGCTGATGCCG-[BHQ2] 3'), включенного в смесь ПЦР в концентрации, идентичной что и для зондов ДНК генов stx1 и stx2 (как помечены [флюоресцином] и [BHQ1] на их 5'- и 3'-концах соответственно). В общей сложности 64 копий IAC следует использовать в реакции ПЦР. Продукт ПЦР МАК96 парных оснований. Производительность в результате stx-IAC ПЦР в режиме реального времени было показано с помощью искусственно и естественно загрязненных проб пищевых продуктов (см. [5]).

Вторая и третья системы также могут быть использованы в качестве контроля экстракции путем добавления 100 копий плазмиды pUC 19 или plAC-STEC в пробу перед стадией очистки ДНК.