6. БОЛЕЗНИ ПТИЦ

     

БОЛЕЗНЬ МАРЕКА (НЕЙРОЛИМФОМАТОЗ ПТИЦ)

     
6.17. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ МАРЕКА (НЕЙРОЛИМФОМАТОЗА) ПТИЦ

УТВЕРЖДЕНЫ 1 марта 1979 г., N 115-6а

     1. Общие положения

1.1. Лабораторная диагностика болезни Марека заключается в: обнаружении антигена в эпителии перьевых фолликулов в реакции диффузионной преципитации (РДП); выявлении антител в сыворотке крови в РДП; обнаружении гистологических и цитологических изменений в органах и тканях.

При необходимости вирус болезни Марека выделяют на развивающихся эмбрионах кур (РЭК) и чувствительной культуре клеток с последующей идентификацией его в РДП и определением патогенности вируса на суточных цыплятах.

     2. Отбор и подготовка материала

2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5...10 живых, клинически больных цыплят, от которых берут кровь, а при вскрытии - патологический материал (кусочки пораженных органов, кожи, мышц, периферических нервов - плечевого, крестцово-седалищного сплетения, фабрицеву сумку, тимус). Патологический материал используют для вирусологических (не позднее 2...3 ч после взятия) и патоморфологических исследований. Кроме того, от больных цыплят берут перья, как указано в п.2.3, для обнаружения вирусного антигена.

2.2. Из цельной крови после отстаивания отделяют сыворотку, которую исследуют в РДП. Часть крови стабилизируют добавлением 15...20 ЕД/мл гепарина или 5%-ным раствором цитрата натрия в соотношении 1:9 и используют для заражения цыплят и РЭК.

2.2.1. Пораженные опухолями печень, почки, селезенку растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на растворе Хенкса, среде Игла или физиологическом растворе. К суспензии добавляют по 1000 ЕД/мл пенициллина, стрептомицина, 40...50 ЕД/мл нистатина и выдерживают при 4°С в холодильнике в течение 40...60 мин. Если опухоли во внутренних органах больных птиц визуально не обнаруживаются, то для заражения используют только стабилизированную кровь.

2.3. Для выявления антигена болезни Марека от каждой исследуемой птицы с наружной поверхности бедра выщипывают по 10...15 перьев с наличием производящей ткани (эпителия перьевых фолликулов) внутри очина. Очины пера измельчают ножницами на кусочки по 1...2 мм, затем их растирают в ступке или гомогенизаторе. Полученную массу заливают физиологическим раствором 1:10, 3 раза замораживают и оттаивают, после чего выдерживают сутки при 4°С. Надосадочную жидкость используют в качестве испытуемого антигена.

     3. Обнаружение вирусного антигена в эпителии перьевых фолликулов и антител в сыворотке крови в реакции диффузионной преципитации

3.1. В РДП исследуют не менее 10 проб сывороток крови птиц и 10 антигенов (проб пера) от цыплят 30...150-дневного возраста и взрослой птицы.

3.2. РДП ставят в агаровом геле.

3.3. Компоненты реакции: специфическая преципитирующая сыворотка; контрольная отрицательная сыворотка; специфический антиген; контрольный отрицательный антиген; испытуемый материал.

3.4. Агаровую среду готовят по прописи: агар "Дифко" - 1 г, хлористый натрий - 8 г, вода дистиллированная - 100 мл. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, затем фильтруют через два слоя марли и доводят рН смеси до 7,2...7,4 10%-ным раствором едкого натра. Среду консервируют мертиолятом (0,01% к общему объему) и хранят при температуре 4°С 12...14 сут.

Перед постановкой реакции агар расплавляют и разливают тонким слоем в чашки Петри или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки.

3.5. Постановка реакции

3.5.1. Для идентификации антигена в центральные лунки вносят специфическую сыворотку, а в периферические - испытуемый антиген.

Контроли: 1) специфический антиген + специфическая сыворотка; 2) специфический антиген + отрицательная сыворотка.