3. БОЛЕЗНИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

     

ЛЕЙКОЗ

     
3.4. ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ "ЛЕЙКОЗ" ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ВИРУСА ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА (КРС) МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

УТВЕРЖДЕНА 19 мая 2009 г.

Тест-система "ЛЕЙКОЗ" для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) выпускается в двух вариантах.

Вариант EPh - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофоретической детекцией продуктов амплификации в агарозном геле.

Вариант FRT - для выявления ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (bovine leukosis virus) в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Тест-система выпускается в двух вариантах.

Вариант EPh

В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:

- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- "ПЦР-комплект" вариант 50R - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота;

- "ЭФ" вариант 200 - комплект реагентов для электрофоретической детекции продуктов амплификации в агарозном геле.

Вариант FRT

В состав тест-системы "ЛЕЙКОЗ", рассчитанной на проведение 50 анализов, включая контроли, входят:

- "ДНК-сорб-В" вариант 50 - комплект реагентов для выделения ДНК из клинического материала;

- "ПЦР-комплект" вариант FRT - комплект реагентов для ПЦР-амплификации ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени.

1.1. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" вариант 50 состоит из следующих компонентов:

Комплект реагентов рассчитан на выделение ДНК из 50 проб, включая контроли.

1.2. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R состоит из следующих компонентов:

Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:

1.3. Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT состоит из следующих компонентов:

Комплект реагентов рассчитан на постановку 55 реакций амплификации, включая контроли.

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются контрольные образцы этапа выделения:

Комплект реагентов "ЭФ" вариант 200 состоит из следующих компонентов:

Комплект реагентов рассчитан на электрофоретический анализ 240 образцов (из расчета 100 мл геля - 5 рядов по 24 лунки).

2. Упаковка и маркировка

На пробирках (флаконах) с каждым компонентом должна быть наклеена этикетка с указанием краткого наименования компонента, количества препарата в пробирке (флаконе), номера серии и даты изготовления. Комплекты реагентов упаковывают в отдельные застегивающиеся пакеты из полиэтилена. На каждый пакет наклеивают (или вкладывают) этикетку с указанием наименования комплекта, перечня компонентов, входящих в комплект, количества пробирок каждого компонента, количества препарата в каждой пробирке (флаконе), номера серии комплекта, условий хранения, даты изготовления, срока годности.

Комплекты реагентов вкладывают в картонную коробку (пакет из полиэтилена). На каждую упаковку тест-системы наклеивают (или вкладывают) этикетку, на которой указывают: наименование предприятия-изготовителя, полное наименование тест-системы, перечень комплектов, входящих в тест-систему, номер серии, дату изготовления, срок годности, условия хранения, обозначение СТО и надпись "Для животных". В каждую упаковку вкладывают инструкцию по применению тест-системы.

3. Транспортирование и хранение

Тест-систему транспортировать при температуре от 2 до 8°С не более 5 сут. При получении разукомплектовать в соответствии с указанными температурами хранения. Комплект реагентов "ДНК-сорб-В" хранить при температуре от 2 до 25°С.

Вариант EPh.

Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант 50R хранить при температуре от 2 до 8°С. Комплект реагентов "ЭФ" хранить при температуре от 18 до 25°С в защищенном от света месте.

Вариант FRT.

Комплект реагентов "ПЦР-комплект" вариант FRT (кроме ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус и полимеразы (TaqF)) хранить при температуре от 2 до 8°С. ПЦР-смесь-1-FRT BLV-провирус и полимеразу (TaqF) хранить при температуре не выше -16°С. Следует избегать длительного нахождения ПЦР-смеси-1-FRT BLV-провирус на свету.

4. Срок годности тест-системы - 12 мес. с даты изготовления.

II. ПРИНЦИП МЕТОДА

5. Вариант EPh. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы. Для контроля качества проведения анализа вместе с последовательностью ДНК провируса (в одной пробирке) проводится амплификация эндогенного внутреннего контроля гена а-актина КРС.

Вариант FRT. В основе метода лежит амплификация специфического участка ДНК провируса лейкоза крупного рогатого скота (последовательности, интегрированной в ДНК лейкоцитов КРС) за счет многократного повторения циклов денатурации ДНК в исследуемой пробе, отжига специфических олигонуклеотидных затравок (праймеров) и зондов, меченных флуоресцентными красителями, и синтеза комплементарных цепей ДНК с помощью фермента Taq-полимеразы.

III. ОТБОР И ПОДГОТОВКА МАТЕРИАЛА ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ

6. Тест-система "ЛЕЙКОЗ" предназначена для выявления ДНК провируса лейкоза КРС в цельной крови КРС у животных старше 14-дневного возраста методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Вариант EPh. Продукты амплификации определяют путем электрофоретической детекции в агарозном геле.

Вариант FRT. Продукты амплификации определяют путем гибридизационно-флуоресцентной детекции в режиме реального времени.

6.1. При отборе образцов материала, а также при подготовке проб для исследования необходимо соблюдать меры, предупреждающие обсеменение объектов внешней среды, руководствуясь при этом действующими правилами и инструкциями.

6.2. Материал от каждого животного отбирают отдельными инструментами.

6.3. Для исследования используют цельную кровь.

7. Отбор материала для исследования

7.1. Кровь для исследования отбирают из хвостовой вены в стерильные пробирки с 3%-ным раствором ЭДТА из расчета 10:1 (или с цитратом натрия в стандартной концентрации). Желательно использовать одноразовые системы взятия крови "Моноветт". Закрытую пробирку с кровью несколько раз переворачивают. Пробы цельной крови используют для выделения ДНК без предварительной подготовки.

7.2. Материал доставляют в лабораторию не позднее чем через 3 дня от момента забора материала. Хранить материал следует при температуре от 2 до 8°С.

IV. ПОРЯДОК ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР

Вариант EPh. ПЦР-анализ проводят в три этапа в отдельных помещениях (зонах).

Вариант FRT. ПЦР-анализ проводят в два этапа в отдельных помещениях (зонах).

Для работы требуются следующие материалы и оборудование.

8.1.* ЗОНА 1 - для выделения ДНК из исследуемого материала:

__________________

* Нумерация соответствует оригиналу. - Примечание изготовителя базы данных.          

- ламинарный бокс (например, "БАВп-01-"Ламинар-С"-1,2", "Ламинарные системы", Россия, класс биологической безопасности II, тип А);

- твердотельный термостат для пробирок типа "Эппендорф" от 25 до 100°С (например, "ТЕРМО 24-15", "Биоком", Россия);