ГОСТ Р ИСО 29701-2015

Группа Т58

     

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

НАНОТЕХНОЛОГИИ

Наноматериалы для испытаний в тест-системах . Метод определения содержания эндотоксинов с использованием лизата амебоцитов (ЛАЛ-тест)

Nanotechnologies. Nanomaterials for testing in assay systems . Method for determination of endotoxin using amebocyte lysate (LAL-test)

ОКС 07.030

        11.100.10

Дата введения 2016-07-01

     

Предисловие

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным государственным учреждением "Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук" (ФИЦ Биотехнологии РАН) на основе собственного аутентичного перевода на русский язык стандарта, указанного в пункте 4

2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 441 "Нанотехнологии"

3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 23 ноября 2015 г. N 1941-ст

4 Настоящий стандарт идентичен международному стандарту ISO 29701:2010* "Нанотехнологии. Испытания эндотоксинов на образцах наноматериалов для систем in vitro. Испытание Limulus amebocyte lysate (LAL)" (ISO 29701:2010 "Nanotechnologies - Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems - Limulus amebocyte lysate (LAL) test").

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ Р 1.5-2012 (пункт 3.5)

5 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Правила применения настоящего стандарта установлены в ГОСТ Р 1.0-2012 (раздел 8). Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе "Национальные стандарты", а официальный текст изменений и поправок - в ежемесячном информационном указателе "Национальные стандарты". В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя "Национальные стандарты". Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования - на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)

     1 Область применения

Настоящий стандарт распространяется на наноматериалы для испытаний в тест-системах in vitro и устанавливает метод определения содержания (количественной концентрации) эндотоксинов с использованием лизата амебоцитов (ЛАЛ-тест). ЛАЛ-тест применим для водных суспензий или экстрактов наноматериалов, пригодных для инкубирования при температуре 37°С.

     2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

2.1 коагулоген (coagulogen): Способный свертываться белок, в результате реакции которого с эндотоксинами при проведении ЛАЛ-теста происходит увеличение вязкости испытуемого раствора и образование плотного геля.

Примечание - Коагулоген получают из клеток крови японского мечехвоста (Tachypleus tridentatus). Коагулоген состоит из 175 аминокислот. Молекулярная масса коагулогена - 19723 [7].

2.2 коагулин (coagulin): Фрагмент коагулогена, образующийся в результате протеолиза коагулогена и свертывающегося фермента при проведении ЛАЛ-теста.

Примечание - Коагулин получают из клеток крови японского мечехвоста (Tachypleus tridentatus). Коагулин состоит из N-концевых фрагментов пептидов (Ala 1 - Arg 18) и С-концевых фрагментов пептидов (Gly47 - Phe175) [7].

2.3 эндотоксин (endotoxin): Компонент наружной части клеточной мембраны грамотрицательных бактерий.

Примечание - Основным активным компонентом эндотоксинов являются липополисахариды (ЛПС).

2.4 единица эндотоксина; ЕЭ (endotoxin unit; EU): Стандартная единица активности эндотоксинов.

Примечания

1 Комитетом экспертов по стандартизации биологических препаратов (КЭСБП) Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) в 1996 году установлено значение ЕА, соответствующее 0,1 нг или 10 ЕЭ/нг эндотоксинов кишечной палочки (Escherichia coli) Американского национального стандарта эндотоксина (АНСЭ) [8].

2 Одна ЕЭ соответствует одной международной единице (ME) эндотоксина.

2.5 чувствительность ЛАЛ-реактива (lambda, ): Значение концентрации эндотоксинов, заявленное изготовителем и используемое при вычислениях в гель-тромб тесте, при построении стандартной кривой в турбидиметрических и хромогенных методах, выраженное в ЕЭ/мл.

2.6 лизат амебоцитов Limulus; ЛАЛ-реактив (Limulus amebocyte lysate; LAL): Водная вытяжка из клеток крови (амебоцитов) мечехвоста Limulus polyphemus (ЛАЛ-реактив) или Tachypleus tridentatus (ТАЛ-реактив).

2.7 метод определения содержания эндотоксинов с использованием лизата амебоцитов Limulus; ЛАЛ-тест (Limulus amebocyte lysate test; LAL test): Способ определения количественной концентрации бактериальных эндотоксинов в испытуемом материале с применением ЛАЛ-реактива.

Примечание - ЛАЛ-тест имеет другое наименование "Испытание на бактериальные эндотоксины" (БЭТ).

2.8 оптическая плотность; ОП (optical density; OD): Величина, равная десятичному логарифму величины, обратной коэффициенту пропускания.

2.9 испытуемая проба (test sample): Водная суспензия или экстракт наноматериала, являющиеся объектом испытания.

     3 Обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие обозначения и сокращения:

     4 Общие требования

4.1 Хранение наноматериалов

Наноматериалы, благодаря большой удельной площади поверхности, могут адсорбировать загрязняющие вещества, в том числе эндотоксины. До проведения испытаний наноматериалы следует хранить в герметичных контейнерах, не содержащих эндотоксинов (далее - НСЭ), например, в стерильных стеклянных контейнерах. Для проверки контейнеров на содержание эндотоксинов применяют порошки оксидов металлов или металлоидов, например двуокись титана, диоксид кремния НСЭ.

Примечания

1 Для хранения наноматериалов не допускается применять контейнеры из полипропилена. Полипропилен является мешающим фактором и оказывает влияние на результаты ЛАЛ-теста (см. приложение А).

2 Порошки оксидов металлов и металлоидов, не содержащие эндотоксины, получают путем термической обработки (см. 4.2).

4.2 Контейнеры для хранения наноматериалов

Хранение наноматериалов и испытуемых проб осуществляют в герметичных контейнерах НСЭ. Для удаления эндотоксинов контейнеры подвергают термической обработке при температуре не менее 250°С в течение 30 мин. Допускается для хранения наноматериалов и испытуемых проб применять стерильные контейнеры из полистирола однократного применения.

4.3 Обращение с наноматериалами

Для испытаний применяют наноматериалы НСЭ. В процессе отбора, подготовки проб и проведения испытаний следует применять меры, предотвращающие загрязнение наноматериалов эндотоксинами, содержащимися в воздухе окружающей среды. Требования к условиям проведения отбора, подготовки проб и испытаний установлены в 6.5.

     5 Испытуемая проба

5.1 Водная суспензия наноматериала

В качестве испытуемой пробы в ЛАЛ-тесте применяют водную суспензию, полученную путем диспергирования пробы наноматериала в воде для ЛАЛ-теста НСЭ.

5.2 Экстракт наноматериала

В качестве испытуемой пробы в ЛАЛ-тесте применяют экстракт наноматериала, полученный путем экстрагирования пробы наноматериала в экстрагирующем растворе (например, физиологическом растворе).

     6 Приготовление испытуемой пробы

В программах и методиках испытаний должны быть установлены требования к приготовлению испытуемых проб. Сведения о применяемых методах отбора и подготовки пробы регистрируют в протоколе испытаний.

6.1 Метод диспергирования

Приготовление испытуемой пробы методом диспергирования выполняют с учетом цели испытаний и требований, установленных для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Пробу наноматериала измельчают вручную, механизированным способом или ультразвуком, затем диспергируют в воде для ЛАЛ-теста НСЭ.

Примечание - Следует учитывать, что процесс диспергирования может быть затруднен вследствие наличия у наноматериалов таких характеристик, как большая удельная площадь поверхности, пористость, гидрофобность.

6.2 Метод экстрагирования

Приготовление испытуемой пробы методом экстрагирования выполняют с учетом требований, установленных для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Экстрагирующие растворы, время и температура инкубирования, концентрация испытуемой пробы должны соответствовать требованиям, установленным для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro. Для контроля значений рН не рекомендуется применять феноловый красный индикатор, влияющий на цвет раствора. Контроль значений рН следует выполнять с применением буферных растворов. Для подготовки испытуемой пробы допускается применять готовые сертифицированные или самостоятельно приготовленные из реактивов НСЭ экстрагирующие растворы НСЭ. Во избежание роста бактерий и плесневых грибов допускается в экстрагирующие растворы добавлять антибиотики и фунгициды. Следует учитывать, что применяемые антибиотики и фунгициды могут являться мешающими факторами и оказывать влияние на результаты ЛАЛ-теста (см. 7.3.3). После проведения экстрагирования полученную смесь центрифугируют с целью удаления частиц. Образовавшийся супернатант переносят с помощью пипеток в пробирки или контейнеры. Отобранный супернатант представляет собой экстракт наноматериала.

Примечания

1 Для удаления эндотоксинов со стекловолоконных фильтров, применяемых для фильтрации проб, можно использовать 0,05% полисорбат 20 [9].

2 Для удаления эндотоксинов из углеродных наноматериалов рекомендуется применять поверхностно-активные вещества, например раствор витамина Е массовой долей 0,1% (-токоферол полиэтиленгликоль-1000 сукцината) [10].

3 При приготовлении испытуемой пробы методом экстрагирования допускается использовать дополнительные сведения [1].

6.3 Концентрация наноматериала в испытуемой пробе

Концентрация наноматериала в испытуемой пробе должна быть максимально высокой и соответствовать требованиям, установленным для испытаний с использованием конкретной тест-системы in vitro.

6.4 Хранение испытуемой пробы

Во избежание разрушения эндотоксинов и/или роста бактерий приготовление испытуемой пробы рекомендуется осуществлять непосредственно перед проведением ЛАЛ-теста.

В случае если сразу провести ЛАЛ-тест невозможно, то хранение испытуемой пробы осуществляют в стерильных герметичных контейнерах (см. 4.2) при температуре от 2 до 8°С. В случае хранения испытуемой пробы более 24 ч выполняют проверку ее стабильности и однородности. Требования к хранению испытуемых проб должны быть установлены в программах и методиках испытаний.

6.5 Условия проведения отбора, подготовки проб и испытаний