МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
МЕТОДЫ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В КЛИНИЧЕСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

УТВЕРЖДЕНЫ Министерством здравоохранения РСФСР от 19 декабря 1991 г.

Методические рекомендации составил А.Н.Калюк.

Бактериологические исследования на условно-патогенные микроорганизмы

Комплексное лабораторное изучение микрофлоры включает бактериоскопическое и бактериологическое исследования материала, проводимые в динамике при поступлении на стационарное лечение, в процессе лечения, а также по показаниям у больных, лечащихся амбулаторно. Посевы диагностического материала целесообразно производить на плотные питательные среды, что исключает подавление роста одного микроорганизма другим и позволяет дать количественную оценку числа выросших колоний. Интенсивность роста микроорганизмов может выражаться в крестах и соответствовать содержанию определенного количества микробных клеток в 1 мл диагностического материала:

++++ обильный рост сливающихся колоний (10 м/кл)

+++ массивный рост изолированных колоний (10 м/кл)

++ умеренный рост множества сосчитываемых колоний (не менее 50) (10-10 м/кл)

+ скудный рост единичных колоний (30-50) (10 м/кл).

При дозированном посеве определяют абсолютное содержание микроорганизмов в 1 мл или 1 г исследуемого материала. Этиологически значимым содержанием бактерий в 1 мл (1 г) материала признается 10 и выше. Количественное преобладание определенного вида микроорганизма является одним из показателей его участия в гнойно-воспалительном процессе. Окончательная интерпретация результатов бактериологического исследования производится после изучения анамнестических данных, клинической симптоматики, результатов антибактериальной терапии. При направлении материала на посев необходимо соблюдать определенные правила. Материал должен быть исследован до начала антибактериальной терапии или через такой период после введения антибактериальных препаратов, который необходим для их элиминации из организма больного (2-3 дня при анализах мокроты, 4-7 дней - мочи). Применение антибиотиков в 3-4 раза снижает частоту выделения микроорганизмов. Посевы диагностического материала проводятся в динамике (3-5 раз), что уточняет этиологию заболевания, дает возможность проследить длительность персистенции возбудителя, контролировать эффективность проводимой терапии. Интервал между сбором и посевом материала не должен превышать 1-2 ч.

Исследование микрофлоры верхних дыхательных путей (глотка, нос, ротовая полость). Материалом для исследования служат: слизь, гнойное отделяемое, корочки, пленка, кусочки инфильтратов при биопсии. Материал для микробиологического исследования из ротовой полости забирают натощак стерильным ватным тампоном со слизистой оболочки у выхода протоков слюнных желез, поверхности языка, из язвочек (соскоб ложечкой), с наиболее пораженных мест. При наличии пленки последнюю снимают пинцетом. Материал из носовой полости забирают сухим стерильным ватным тампоном. Материал засевают на чашки Петри с кровяным, желточно-солевым агарами, среду Сабуро. При посеве тампоном материал втирают в среду со всей поверхности тампона на небольшом участке 1-2 см, а затем штрихами по всей поверхности. Одновременно с посевом приготавливают мазки и окрашивают по Граму.

Исследование микрофлоры нижних дыхательных путей. Основным материалом для исследования является мокрота, которая собирается в день исследования, утром, после чистки зубов и полоскания полости рта свежекипяченой водой. При обильном выделении мокроты первые порции следует откашлять в плевку, а последующие собираются в стерильную посуду и доставляются в лабораторию. Для изучения микрофлоры мокроты применяют как посев неразведенной мокроты (качественный метод), так и метод разведения, который получил название количественного. При качественном методе для посева используются гнойные комочки мокроты, отмытые в физиологическом растворе от микрофлоры ротовой полости. При количественных методах гомогенизируется 1 мл мокроты. Затем производятся разведения, позволяющие уменьшить в ней количество микроорганизмов ротовой полости. При обоих методах одновременно с посевом приготавливается мазок, который окрашивается по Граму. Исследованию подлежат гнойная и слизисто-гнойная мокрота, в которой присутствуют лейкоциты и клетки альвеолярного эпителия, клетки, вкрапленные в муцин, присутствие которых характерно для экскрета нижних отделов дыхательных путей. Обращают внимание на преобладающую в мазке нативной мокроты микрофлору, особенно капсульные диплококки (пневмококки), мелкие грамотрицательные палочки (палочка Пфейффера) и др.

Качественный метод. В лаборатории мокроту выливают в чашку Петри, выбирают 2-3 гнойных комочка, которые однократно отмывают в физиологическом растворе, после чего засевают на кровяной и желточно-солевой агары, среды Эндо и Сабуро. Посев производят стерильным стеклянным шпателем, равномерно растирая материал на поверхности питательной среды. На чашку с кровяным агаром сразу же после посева накладывают диски с антибиотиками (стрептомицином, пенициллином, тетрациклином, эритромицином и левомицетином), что позволяет получить экспресс-информацию о лекарственной чувствительности преобладающей в посеве микрофлоры. На второй день учитывают количество выросших колоний (этиологически значимым считается рост более 50 колоний), однородность популяции и лекарственную чувствительность при росте их в монокультуре.

Количественный метод. Из доставленной в лабораторию мокроты берут 1 мл, добавляют 9 мл мясопептонного бульона и гомогенизируют в банке с бусами в течение 20 мин. Из полученной эмульсии готовят десятикратные последовательные разведения. Посев осуществляют в обратном порядке с меньшего разведения. Засевается по 0,1 мл из разведенной мокроты 10 и 10 на чашку с кровяным агаром. Посев на желточно-солевой агар, среды Эндо и Сабуро делают из исходного разведения 1:10. Посевы инкубируют в течение суток при 37°С. На вторые сутки чашки просматривают и учитывают численность каждого из видов микроорганизмов в миллионах. Диагностически значимым признается содержание бактерий 10 м/кл и выше в 1 мл мокроты.

Посев промывных вод бронхов, лаважной жидкости. Из исследуемого материала отбирают комочки слизи, которые без предварительного отмывания в физиологическом растворе засевают на плотные питательные среды (см. посев мокроты) и в пробирку с сахарным бульоном. При отсутствии комочков слизи производят посев материала, набранного в пастеровскую пипетку. Инкубация в течение суток при 37°С.

Исследование микрофлоры глаз. Пробы на исследование отбирает врач стерильным ватным тампоном или стеклянной палочкой. Материал забирается с пораженных мест и засевается в 0,5% сахарный бульон. В случае отсутствия роста через 48 часов выдается отрицательный ответ.

Исследование мазков из уха. Материал забирают стерильным ватным тампоном из слухового канала и производят посев на кровяной и желточно-солевой агары, среду Сабуро, втирая материал на участке среды, после чего растирают по всей чашке.

Исследование мочи. Исследованию подлежит средняя порция утренней мочи, полученная при нормальном мочеиспускании или взятая катетером. Показателем бактериурии, имеющим клиническое значение, считается наличие 100000 и более микробов в 1 мл мочи.

Первый день исследования. Производят посев одной стандартной (3 мм) бактериологической петли мочи (тщательно перемешанной) по секторам А, I, II и III в чашку Петри с 5% кровяным или простым агаром. При этом в участке среды сектора А делают посев, равномерно втирая материал по всей поверхности, затем не беря нового материала, этой же петлей делают посев штрихами на питательную среду в секторе I (3-4 штриха), из сектора I во II, из II сектора - в III.

Таблица 1

     
Число колоний бактерий в различных секторах чашки Петри в зависимости от степени бактериурии (по В.С.Рабиновскому и В.В.Родоман)

Второй день исследования. Определяют степень бактериурии по табл.1 в зависимости от того, в каком секторе обнаружен рост колоний микроорганизма. При наличии менее 100 тыс. микробов в 1 мл мочи рост колоний наблюдается только в секторе А чашки Петри. Появление роста колоний в I секторе указывает на более высокую степень бактериурии. Подсчет колоний в секторе с наименьшим ростом не представляет труда. Метод секторных посевов в большинстве случаев позволяет уже на второй день исследования выделить возбудителя заболевания в чистой культуре.

Исследование микрофлоры ран, пунктатов, экссудатов, резецированных тканей. Экссудаты и пунктаты засевают пастеровской пипеткой в пробирки с кровяным и простым мясопептонным агаром, сахарным бульоном. Тампон с диагностическим материалом засевают на чашки Петри с 5% кровяным и 10% желточно-солевым агарами. Материал втирается по краю среды, а затем рассеивается по чашке при помощи этого же тампона или бактериологической петли.

Исследование микрофлоры женских половых органов. Выделения собирают с помощью стерильного ватного тампона и засевают на чашки Петри с 5% кровяным агаром, желточно-солевым агаром и в пробирку с сахарным бульоном, а также на среду Эндо.

Исследование желчи. Желчь собирают при зондировании или во время операции в стерильные пробирки и доставляют в лабораторию не позднее 2 ч. от момента забора. 0,1 мл желчи высевают на чашку с кровяным агаром и на среду Эндо. Посевы и оставшийся исходный материал помещают в термостат при 37°С. Через 24 часа учитывают результаты первичных посевов с подсчетом количества колоний каждого вида на плотных питательных средах.

Исследование крови. Кровь сеют у постели больного после тщательной обработки кожи (спирт, эфир). Из локтевой вены берут 10 мл крови, которую выливают в две колбы: первую со 150-200 мл сахарного бульона и вторую с тиогликолевой средой (по 5 мл). Посевы выдерживают в термостате в течение 10 дней. На 2, 3, 5 и 10-й дни производят контрольные высевы на чашки Петри с 5% кровяным агаром. Посев 5 мл крови можно произвести во флакон с питательной средой в двух фазах: плотной и жидкой (скос 5% кровяного агара с 1% глюкозы и 50 мл 0,5% сахарного бульона). Такая методика исключает необходимость многократных пересевов, устраняет возможность загрязнения посева микрофлорой окружающей среды, позволяет учесть количество выросших колоний (т.е. оценить напряженность бактериемии). Посев помещают в термостат при 37°С на 10 суток. Ежедневно содержимое флаконов взбалтывают и наклоном флакона смачивают поверхность скоса плотной питательной среды. При появлении роста колоний на скосе кровяного агара с них приготавливают мазки и далее идентифицируют по общепринятым в бактериологии правилам. При отсутствии роста микроорганизмов на 10-е сутки дается окончательный ответ - посев крови стерилен.

Исследование на дисбактериоз кишечника. На предварительно подготовленные и взвешенные (подпергамент или вощанку) стерильные бумажки размером 3x2 берут произвольное количество фекалий и взвешивают на торзионных весах. Бумажку вместе с материалом помещают в стерильную пробирку. Вес навески фекалий, за вычетом веса бумажки, умножают на 9. Полученная после умножения сумма равна количеству физиологического раствора, которое необходимо добавить в пробирку. Разведение 1:10 (I).

Например: вес бумажки 20 мг

вес фекалий с бумажкой 420 мг

420-20=400 мг; 400 мг9=3600 (3,5 мл).