ГОСТ 32372-2013 Методы испытания по воздействию химической продукции на организм человека. In vitro 3T3 NRU тест на фототоксичность

     4 Подготовка

4.1 Клетки

Для проведения исследования рекомендуют группу клеток мышиного фибробласта, Balb/c 3Т3, клон 31 или другие клетки и клеточные линии, если условия культивирования клеток адаптированы для их специфических потребностей.

Клетки регулярно проверяют на отсутствие загрязнения микоплазмой и используют, только если загрязнение не выявлено.

Регулярно проверяют УФ чувствительность клеток.

Используют Balb/c 3Т3 клетки самого низкого пересева, предпочтительно менее 100, так как УФ А чувствительность клеток возрастает с числом пересевов.

4.2 Среда и питательные условия

При обычном пересеве и во время процедуры эксперимента используют соответствующие условия питательной среды и условия инкубации.

Пример - для Balb/c 3Т3 клеток используют среду DMЕМ (питательная среда для клеток млекопитающих) с добавлением 10% сыворотки крови новорожденных телят, 4 ммоль глутамина, пенициллин (100 ME), стрептомицин (100 мг/мл) и влажную инкубацию при 37°С, от 5,0% до 7,5% СО в зависимости от буферного раствора.

Питательная среда должна обеспечивать нормальную продолжительность клеточного цикла или используемой клеточной линии.

4.3 Культура

Клетки из замороженных чистых культур высевают на питательную среду с определенной плотностью и пересевают как минимум один раз перед использованием.

Культуры не должны сливаться до конца исследования (на момент определения клеточной жизнеспособности, определяемой через 48 часов после посева).

Пример - для Balb/c 3Т3 клеток, растущих в планшете с 96 ячейками, рекомендуемая плотность посева составляет 110 клеток на ячейку.

Для каждого исследуемого вещества клетки высевают в два отдельных планшета с 96 ячейками, которые затем используют параллельно в течение всего эксперимента при одинаковых условиях культивирования, исключая период времени, когда один из планшетов облучают , а другой держат в темноте .

4.4 Исследуемое вещество

Тестируемый раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.

Рекомендуется использовать химические вещества и проводить первоначальную обработку клеток при световых условиях, которые позволят избежать фотоактивации или деградации исследуемого вещества до облучения.

Исследуемые вещества должны быть растворены в соленом буферном растворе, например, в сбалансированном солевом растворе Эрла (EBSS) или в других физиологически сбалансированных солевых растворах, которые не должны содержать протеиновых компонентов, компонентов, поглощающих свет (например, красителей - индикаторов рН и витаминов) во избежание помех во время облучения.

Во время облучения необходимо избегать защелачивания, так как клетки выдерживают в течение примерно 50 минут вне инкубатора. При использовании слабых буферов, таких как EBSS, это может достигаться путем инкубации клеток при 7,5% . Если клетки инкубируют в 5% , то должен быть использован более сильный буфер.

Для тестирования веществ, имеющих плохую растворимость в воде, необходимо их растворить в соответствующем растворителе. Если используют растворитель, то он должен присутствовать в постоянном объеме во всех культурах, в том числе в отрицательном контрольном эксперименте (с растворителем), так же как и во всех концентрациях исследуемого вещества, и не должен быть цитотоксичным в данной концентрации. Исследуемые концентрации веществ должны быть подобраны так, чтобы избежать образования осадка или помутнения раствора.

Рекомендуется использовать в качестве растворителей диметилсульфоксид (DMSO), этанол (ЕtOН) и другие растворители с низкой цитотоксичностью. Перед использованием необходимо провести оценку специфических свойств растворителей.