ГОСТ 32372-2013

     

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

     

МЕТОДЫ ИСПЫТАНИЯ ПО ВОЗДЕЙСТВИЮ ХИМИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ НА ОРГАНИЗМ ЧЕЛОВЕКА

     
In vitro 3Т3 NRU тест на фототоксичность

     
Methods of testing of chemicals of health hazard. In vitro 3T3 NRU phototoxicity test

МКС 71.040.10

Дата введения 2014-08-01

Предисловие

Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 "Межгосударственная система стандартизации. Основные положения" и ГОСТ 1.2 "Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены"

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Федеральным бюджетным учреждением здравоохранения "Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФБУЗ "Российский регистр потенциально опасных химических и биологических веществ" Роспотребнадзора), Федеральным государственным унитарным предприятием "Всероссийский научно-исследовательский центр стандартизации, информации и сертификации сырья, материалов и веществ" (ФГУП "ВНИЦСМВ")

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. N 44)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. N 773-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32372-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 августа 2014 г.

5 Настоящий стандарт идентичен международному документу OECD, Test N 432:2004* "In vitro 3T3 NRU тест на фототоксичность" ("In vitro 3Т3 NRU phototoxicity test", IDT).

________________

* Доступ к международным и зарубежным документам, упомянутым в тексте, можно получить, обратившись в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5 (подраздел 3.6)

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

7 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Апрель 2019 г.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
     
     В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге "Межгосударственные стандарты"

Введение

Установлено, что многие типы веществ могут индуцировать фототоксический эффект. Их общее свойство - это способность поглощать световую энергию в диапазоне солнечного излучения. В соответствии с первым законом фотохимии (закону Гротгуса-Дрейпера), фотореакции требуют достаточного поглощения световых квантов. Предполагается, что если молярная оптическая плотность/коэффициент поглощения менее чем 10 лмольсм, то вещество не является фотореакционным. Подобное вещество, возможно, не нужно исследовать на фототоксичность с использованием in vitro 3Т3 NRU теста или любого другого биологического теста [1].

Исследование фототоксичности in vitro 3Т3 NRU тестом позволяет прогнозировать острый фототоксический эффект в тестах in vivo на животных и человеке. Тест не позволяет прогнозировать другие неблагоприятные эффекты, которые могут возникнуть при комбинированном воздействии вещества и света, например: он не определяет фотогенотоксичность, фотоаллергическую реакцию, фотоканцерогенность и не позволяет оценивать фототоксический потенциал. Тест также не позволяет определять непрямые механизмы фототоксичности, эффекты метаболитов исследуемого вещества или эффекты смесей.

Так как до настоящего времени использование метаболизирующих систем является основным требованием всех тестов in vitro для прогноза генотоксичности и канцерогенного потенциала, применительно к фототоксикологии только в редких случаях требуются продукты метаболизма веществ для оценки фототоксического действия в опытах in vivo и in vitro. Таким образом, данный метод тестирования не является обязательным для метаболически активных систем.

     1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает процедуру испытания химической продукции на фототоксичность методом In vitro 3Т3 NRU.

Тест на фототоксичность используется для определения фототоксического потенциала исследуемого вещества, индуцированного тестируемым веществом после экспозиции светом. Тест оценивает фотоцитотоксичность по снижению жизнеспособности клеток, подвергавшихся воздействию химического вещества в присутствии или при отсутствии света. Вещества, выявленные в данном тесте, являются фототоксичными in vivo после системного нанесения и распределения на коже или после местного нанесения.

     2 Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины и обозначения с соответствующими определениями:

2.1 диапазон волн УФ излучения (UV light wavebands): Обозначения, рекомендуемые Международной комиссией по освещению (МКО), следующие: УФ А (от 315 до 400 нм), УФ В (от 280 до 315 нм) и УФ С (от 100 до 280 нм).

Примечание - Другие обозначения также используются; разделение между УФ В и УФ А часто помещается на 320 нм, и УФ А может разделяться на УФ-А1 и УФ-А2 с разделением на отметке 340 нм.

2.2 жизнеспособность клетки (cell viability): Параметр, измеряющий общую активность популяций клеток (например, поглощение витального красителя нейтрального красного (Neutral red) клеточными лизосомами), которая в зависимости от конечной точки измерения и используемой схемы эксперимента коррелирует с общим числом и/или выживаемостью клеток.

2.3 нейтральный красный: Слабый катионный краситель, который легко проникает сквозь клеточные мембраны путем недиффузионного, межклеточного накопления в лизосомах.

2.4 облучение (irradiance): Интенсивность падения на поверхность ультрафиолетового излучения или излучения видимого спектра, измеренная в Вт/м или мВт/см.

2.5 относительная жизнеспособность клетки (relative cell viability): Жизнеспособность клетки, выраженная в отношении контроля за растворителем (отрицательного), который использовался в течение всей процедуры испытания (+Irr, -Irr), но не обрабатывался исследуемым веществом.

2.6 световая доза (dose of light): Количество (интенсивностьвремя) ультрафиолетового (УФ) или видимого излучения, падающего на поверхность и выраженного в Дж (Втс) на площадь поверхности, например: Дж/м и Дж/см.

2.7 фототоксичность (phototoxicity): Острая токсическая реакция, которая появляется после первого воздействия на кожу конкретных химических веществ и при последующей экспозиции светом, или которая вызывается также облучением кожи после системного воздействия химического вещества.

2.8 Balb/c 3Т3 клетки: Фибробласты мышей альбиносов лабораторной линии Американской коллекции типовых культур (АТСС) или Европейской коллекции клеточных культур (ЕСАСС).

2.9 : Концентрация исследуемого вещества, при которой жизнеспособность клетки снижается до 50%.

2.10 (средний фотоэффект): Значение измерения, полученное математическим анализом кривых реакций концентраций, полученных при отсутствии  и в присутствии нецитотоксического облучения УФ А/видимым светом.

2.11 (photo-Irritation-Factor): Фактор, образованный путем сравнения двух одинаково эффективных цитотоксических концентраций () исследуемого вещества, полученный при отсутствии и в присутствии нецитотоксического облучения УФ А/видимого света.

     3 Принцип метода испытания

In vitro 3Т3 NRU тест по изучению фототоксичности основан на сравнении цитотоксичности химического вещества при его воздействии в условиях присутствия и отсутствия нецитотоксичной дозы имитируемого солнечного света. Цитотоксичность в данном тесте выражается как зависимое от концентрации снижение поглощения витального красителя нейтрального красного и измеряемое через 24 часа после воздействия исследуемым химическим веществом и облучением. Изменение чувствительности поверхности лизосомной мембраны ведет к лизосомной хрупкости и другим изменениям, которые постепенно становятся необратимыми. Подобные изменения вызваны воздействием ксенобиотиков, в результате которого снижается поглощение и связывание нейтрального красного. Таким образом, становится возможным отличить жизнеспособные, поврежденные или мертвые клетки, что является основой данного метода исследования.

Balb/c 3Т3 клетки выдерживают в питательной среде в течение 24 часов для формирования монослоев.

Два планшета с 96 ячейками для каждого исследуемого вещества выдерживают предварительно с восемью различными концентрациями вещества в течение часа.

Один из планшетов подвергают воздействию наивысшей нецитотоксичной дозой облучения, другой планшет оставляют в темноте. В обоих планшетах в тестируемую среду вносят культуру клеток и после следующих 24 часов инкубации по поглощению нейтрального красного определяют жизнеспособность клеток.

Жизнеспособность клеток выражается в процентах как по отношению к необработанному тестируемым веществом контролю и вычисляется для каждой тестовой концентрации.

Для определения фототоксического воздействия полученные реакции на концентрации исследуемых веществ в присутствии и при отсутствии облучения сравниваются с уровнем, полученным в эксперименте с необработанным контролем.

     4 Подготовка

4.1 Клетки

Для проведения исследования рекомендуют группу клеток мышиного фибробласта, Balb/c 3Т3, клон 31 или другие клетки и клеточные линии, если условия культивирования клеток адаптированы для их специфических потребностей.

Клетки регулярно проверяют на отсутствие загрязнения микоплазмой и используют, только если загрязнение не выявлено.

Регулярно проверяют УФ чувствительность клеток.

Используют Balb/c 3Т3 клетки самого низкого пересева, предпочтительно менее 100, так как УФ А чувствительность клеток возрастает с числом пересевов.

4.2 Среда и питательные условия

При обычном пересеве и во время процедуры эксперимента используют соответствующие условия питательной среды и условия инкубации.

Пример - для Balb/c 3Т3 клеток используют среду DMЕМ (питательная среда для клеток млекопитающих) с добавлением 10% сыворотки крови новорожденных телят, 4 ммоль глутамина, пенициллин (100 ME), стрептомицин (100 мг/мл) и влажную инкубацию при 37°С, от 5,0% до 7,5% СО в зависимости от буферного раствора.

Питательная среда должна обеспечивать нормальную продолжительность клеточного цикла или используемой клеточной линии.

4.3 Культура

Клетки из замороженных чистых культур высевают на питательную среду с определенной плотностью и пересевают как минимум один раз перед использованием.

Культуры не должны сливаться до конца исследования (на момент определения клеточной жизнеспособности, определяемой через 48 часов после посева).

Пример - для Balb/c 3Т3 клеток, растущих в планшете с 96 ячейками, рекомендуемая плотность посева составляет 110 клеток на ячейку.

Для каждого исследуемого вещества клетки высевают в два отдельных планшета с 96 ячейками, которые затем используют параллельно в течение всего эксперимента при одинаковых условиях культивирования, исключая период времени, когда один из планшетов облучают , а другой держат в темноте .

4.4 Исследуемое вещество

Тестируемый раствор должен быть приготовлен непосредственно перед использованием.