• Текст документа
  • Статус
Оглавление
Поиск в тексте
Действующий


МУК 4.2.3065-13

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     
     
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции


1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Е.Б.Ежлова, А.А.Мельникова, Н.А.Кошкина); ФБУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (М.В.Зароченцев, И.В.Новокшонова); ФБУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Г.Н.Габричевского" Роспотребнадзора (И.К.Мазурова, О.Ю.Борисова, С.Ю.Комбарова, В.Г.Мельников, Н.М.Максимова, Т.Н.Якимова); ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии в г.Москве" Роспотребнадзора (Н.Я.Салова, И.П.Требунских).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 года N 1).

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 июля 2013 г.

4. РАЗРАБОТАНЫ ВЗАМЕН МУ 4.2.698-98 "Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции".

1. Область применения


Методические указания (далее - МУ) предназначены для специалистов бактериологических лабораторий санитарно-эпидемиологической службы, лечебно-профилактических организаций независимо от их организационно-правовой формы и формы собственности и научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику дифтерийной инфекции.

2. Общие положения. Сущность метода


Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции, подтверждения эпидемиологических связей и наблюдения за распространением токсигенных коринебактерий дифтерии. Цель бактериологического исследования - выявление возбудителя дифтерии с помощью минимального количества диагностических тестов, необходимых, достаточных и специфичных для получения достоверного ответа в максимально сжатые сроки: не менее трёх суток - отрицательный ответ, трёх-четырёх суток - ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии (возбудителя дифтерии), четырёх-пяти суток - ответ о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии или других представителей этого рода.

Возбудитель дифтерии - коринебактерии дифтерии (Corynebacterium diphtheriae), продуцирующие дифтерийный токсин (экзотоксин). Источником инфекции является больной или бактерионоситель токсигенных С.diphtheriae.

Нетоксигенные С.diphtheriae не вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этих микроорганизмов при фарингите, артрите, эндокардите и др. гнойно-септических заболеваниях требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов C.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

Способность С.diphtheriae вырабатывать экзотоксин опосредован феноменом фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсию нетоксигенных штаммов С.diphtheriae в токсигенные и наоборот можно воспроизвести в особых экспериментальных (лабораторных) условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией или бактерионосителей выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что токсигенные и нетоксигенные С.diphtheriae колонизировали слизистые ротоглотки и носа одновременно. При лечении антибиотиками в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Обнаружение только нетоксигенных штаммов у бактерионосителей при повторных обследованиях после лечения нельзя трактовать как утрату способности токсигенных штаммов продуцировать экзотоксин.

Таксономически близкими к виду C.diphtheriae являются Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis - природные патогены крупного и мелкого рогатого скота, лошадей, домашних животных, способные вырабатывать дифтериеподобный экзотоксин, в редких случаях могут вызывать заболевания у человека.

Известны случаи выделения токсигенных C.ulcerans при клинической картине заболевания, сходной с дифтерией, а также токсигенных C.pseudotuberculosis, вызывающих лимфадениты. Инфекции, вызванные этими микроорганизмами, у человека встречаются крайне редко, не имеют эпидемического распространения, а, следовательно, значение этих случаев в медицине невелико.

На слизистых оболочках ротоглотки и носа в норме часто встречается Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана). Умение выделять и идентифицировать данные микроорганизмы, а также нетоксигенные C.diphtheriae служит критерием оценки качества работы бактериологов, особенно в период снижения и спорадической заболеваемости дифтерией.

C.diphthereiae растут на питательных средах, сбалансированных по своему составу, и не растут на простых питательных средах. Требуется кровь любого животного или человека (донора), как источник аминокислот, ростовых факторов, железа и пр. Не всегда коммерческие среды удовлетворяют этим требованиям, поэтому контроль качества питательных сред и всех ингредиентов в лабораториях обязателен.

Кровяные теллуритовые среды (КТА, Клауберг II) остаются лучшими селективными дифференциально-диагностическими средами, обеспечивающими рост колоний через 24 ч, что на одни сутки сокращает сроки выдачи окончательного бактериологического ответа. КТА прост в приготовлении: основой этой среды является коммерческий сухой питательный агар (СПА), в качестве кровяных добавок используют кровь, однако не исключены любые гемолизированные кровяные добавки.

Трудоемкость бактериологического метода и стоимость анализа сокращается при использовании двух половин одной чашки с селективной дифференциально-диагностической питательной средой (далее плотная питательная среда) для посева материала из зева и носа от одного обследуемого. Использование МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции чашки для посева таких образцов на плотной питательной среде недопустимо, так как не позволяет, в большинстве случаев, получить рост изолированных колоний и провести исследование в установленные сроки.

Посев материала из зева и носа на кровяной агар производить нецелесообразно, так как очень сложно получить рост изолированных колоний C.diphtheriae на данной среде из-за обильного роста другой сопутствующей микрофлоры.

Колонии, морфология которых характерна для микроорганизмов рода Corynebacterium, в подавляющем большинстве не подлежат микроскопии и должны быть изучены по всем необходимым идентификационным тестам. "Сомнительные" колонии с нехарактерными морфологическими свойствами подвергают микроскопии. Если в мазках обнаруживают коринеформные микроорганизмы, исследование следует продолжить по всем необходимым идентификационным тестам.

Окрашивание мазков осуществляют по Лёффлеру (щелочной метиленовый синий) или с использованием других синих красителей. Окраску по Граму не применяют, т.к. в процессе окраски клетки грамположительных C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть грамотрицательными (розовый оттенок). Чаще всего это явление наблюдают при окрашивании токсигенных C.diphtheriae (клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae ближе по организации и структуре к грамотрицательным микроорганизмам).

В бактериологической практике опираться только на морфологические свойства микробной клетки или колоний при идентификации C.diphtheriae недостаточно. Описаны случаи бактериологической гипо- и гипердиагностики (в 55,0 и 14,5% случаев соответственно), когда использовали учет только морфологических признаков.

При идентификации C.diphtheriae необходим комплекс идентификационных тестов. Основной специфический тест для выявления возбудителя дифтерии, правильная постановка которого является залогом успешной диагностики дифтерийной инфекции, - определение у выделенной культуры способности к продукции дифтерийного токсина. Определять продукцию токсина следует начинать уже в первый день появления роста изолированных колоний на чашках с плотной питательной средой, исключая этап накопления чистой культуры. Несоблюдение этого правила увеличивает сроки исследования на одни сутки.

Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний (двадцать и более) с чашек первичного посева. При множественном росте подозрительных колоний нельзя ограничиться формированием только одной-двух бляшек. Кроме того, необходимо изучать токсигенные свойства отдельных изолированных колоний, чтобы не потерять нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, присутствие которых также возможно при наличии токсигенных C.diphtheriae в патологическом материале.

Используют два способа постановки пробы на токсигенность:

1) модифицированная проба Элека с бумажными полосками, утверждённая для бактериологической практики в нашей стране в 1961 г.;

2) проба Фельдмана Ю.Г. и соавторов с бумажными дисками, разработанная в нашей стране и утвержденная в 1988 г., получившая одобрение Международной рабочей группы ВОЗ по лабораторной диагностике дифтерийной инфекции к применению в зарубежных лабораториях.

В пробе на токсигенность следует использовать только антитоксин - противодифтерийные антитоксические антитела, очищенные методом специфической сорбции, что позволяет избежать появления неспецифических линий преципитации микробного происхождения. В исключительных случаях при отсутствии антитоксина допускается использование лечебной противодифтерийной антитоксической лошадиной сыворотки. В таком случае возможно появление неспецифических линий преципитации микробного происхождения, которые необходимо отличить от специфических линий токсического происхождения.

Обязательными являются биохимические тесты - на цистиназу, уреазу, расщепление глюкозы, сахарозы и крахмала. Тест на нитраты проводят только при положительной уреазной реакции. Использование других тестов, применяемых в некоторых зарубежных странах, необоснованно увеличивает продолжительность, трудоемкость, стоимость исследования и не всегда приводит к точной идентификации "недифтерийных" микроорганизмов (других представителей рода Corynebacterium). При лабораторной диагностике дифтерии не является обязательным определение видовой принадлежности "недифтерийных" коринебактерий рода Corynebacterium, тем более что их идентификация требует отдельных хемотаксономических и молекулярно-генетических методов исследования.

C.diphtheriae подразделяют на культурально-биохимические варианты (биовары) gravis, mitis, intermedius, belfanti. В бактериологической практике определению подлежат биовар gravis и объединенная группа "митисных форм" - mitis, intermedius, belfanti, т.е. группа микроорганизмов C.diphtheriae, которая не обладает амилазной активностью (не разлагает крахмал). Биовар belfanti не подлежит отдельному определению, так как этот микроорганизм не способен продуцировать экзотоксин. В бактериологической диагностике отдельного выделения биовара intermedius так же не требуется, так как относительно условными дифференцирующими признаками от биовара mitis являются только размер колоний и наличие липофильности. Таким образом, в бактериологической диагностике определяются токсигенные и биохимические свойства C.diphtheriae биовара gravis и группы микроорганизмов, у которых отсутствует амилазная активность, объединённые в группу C.diphtheriae биовар mitis.

Молекулярно-генетические методы для лабораторного выявления C.diphtheriae находятся в стадии разработки. Имеющиеся тест-системы для метода ПЦР не могут различить ген дифтерийного токсина токсигенных штаммов от "молчащего" гена дифтерийного токсина нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae, не способных продуцировать токсин из-за мутаций в этом гене. Это может привести к гипердиагностике. Поэтому их использование в лабораторной диагностике дифтерии может иметь только вспомогательное значение - поиск нетоксигенных токснесущих штаммов C.diphtheriae среди нетоксигенных штаммов.

3. Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции


Род Corynebacterium гетерогенный, как и группа, условно объединившая его и другие роды грамположительных палочек, не образующих споры размером 0,3-0,8МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции1,5-8,0 мкм, неподвижных, обладающих различной степенью полиморфизма и плеоморфизма. C.diphtheriae имеют размер 0,2-0,6МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции1,0-7,0 мкм. Арабиногалактановый полимер клеточной стенки C.diphtheriae отличает этот вид от всех других видов рода Corynebacterium. Клеточная стенка С. diphtheriae имеет от 3-5 до 7-9 слоёв. Известно, что клеточная стенка токсигенных C.diphtheriae лучше дифференцирована и более тонкая по сравнению с клеточной стенкой нетоксигенных C.diphtheriae и других коринеформных микроорганизмов этого рода, что определяет их отношение к антибиотикам - токсигенные более чувствительны, чем нетоксигенные к пенициллину, эритромицину, тетрациклину и макролидам. Однако появляются штаммы C.diphtheriae устойчивые к некоторым антибиотикам, преимущественно выделенные от бактерионосителей.

Патогенные для животных Corynebacterium ulcerans и Corynebacterium pseudotuberculosis, некоторые комменсалы кожи со слизистых оболочек человека, например, Corynebacterium pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийная палочка Гофмана), Corynebacterium xerosis, Corynebacterium striatum таксономически близки к виду C.diphtheriae.

Большинство видов лучше растет в аэробных условиях, в том числе и микроорганизмы вида C.diphtheriae. Вместе с тем, C.diphtheriae являются факультативными анаэробами (генерируют энергию, используя как молекулярный ОМУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции, так и органические соединения), что крайне важно учитывать при изучении их ферментативной активности.

Все коринебактерии, в т.ч. и C.diphtheriae, являются мезофилами и растут при 36-37 °С.

Устойчивость к факторам внешней среды

C.diphtheriae устойчивы к низкой и чувствительны к высокой температуре (низкие температуры не убивают дифтерийные палочки длительное время, под действием прямого солнечного света палочки дифтерии гибнут в течение нескольких дней); значительно устойчивы во внешней среде и длительно сохраняют жизнеспособность в дифтерийной плёнке, в капельках слюны, на ручках дверей, детских игрушках до 15 дней; в пыли, на полу, на предметах в окружении больного до 18-40 дней; в сухой дифтерийной плёнке до 7 недель; в воде выживают в течение 6-20 дней. Коринебактерии дифтерии не устойчивы к действию физических и химических обеззараживающих средств и разрушаются под действием обычных дезинфектантов в обычных концентрациях (3-5%) при экспозиции 30 мин; погибают при нагревании до 60 °С в течение 10 мин, кипячение убивает их моментально.

Культурально-морфологические свойства

Обычно колонии микроорганизмов из рода Corynebacterium на плотных питательных средах (например, на кровяном агаре) имеют серовато-белую или желтую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, приподнятые, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, хотя некоторые виды рода Corynebacterium могут образовывать шероховатые R-колонии и крошиться при прикосновении. На питательных средах, сбалансированных по своему составу и удовлетворяющих требованиям культивирования C.diphtheriae, через 24-48 ч роста вариант mitis образует колонии S-типа - приподнятые, гладкие, диаметром 1-2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм.

На селективных дифференциально-диагностических средах - кровяной теллуритовый агар (КТА) и Клауберг II через 24-48 ч роста колонии C.diphtheriae варианта gravis имеют серо-черную или черную окраску с металлическим оттенком ("цвет мокрого асфальта"), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы, диаметром 1-3 мм, имеют радиальную исчерченность (форма "маргаритки") или выраженную краевую изрезанность, часто крошатся при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта mitis имеют серо-черную или черную окраску ("цвет мокрого асфальта"), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, иногда плоские, округлой формы, диаметром 1-2 мм, чаще всего бывают мягкой, маслянистой консистенции или могут крошиться при прикосновении; колонии C.diphtheriae варианта intermedius имеют серо-черную окраску, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1,0 мм, мягкой, маслянистой консистенции.

Морфология колоний C.ulcerans и C.pseudotuberculosis на КТА через 24-48 ч роста идентична морфологии колоний С.diphtheriae варианта gravis, серо-черной или черной окраски ("цвет мокрого асфальта"), иногда с коричневым оттенком, колонии непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром, округлой формы с радиальной исчерченностью (или без неё), диаметром 1-2 мм. Колонии C.pseudodiphtheriticum - серого цвета с характерным светлым ободком, непрозрачные, приподнятые, матовые, округлой формы, диаметром 1-2 мм.

На теллуритовой среде без крови (коринебакагар) колонии C.diphtheriae через 24 ч роста мелкие (иногда 0,2-0,6 мм), через 48 ч роста размер колоний увеличивается до 1,0-1,2 мм, иногда наблюдаются "гигантские" колонии. Однако морфология колоний изменяется - исчезает исчерченность края, к 48 ч колонии меняют характерную для C.diphtheriae архитектонику - плоские, "расползающиеся" по поверхности агара, иногда меняется цвет колоний.

Помимо относительно условной оценки морфологии колоний на питательной среде первичного посева существует несколько других признаков, позволяющих различать биовары gravis, mitis, intermedius. Например, характерный рост на бульоне в пробирке: для биовара gravis - поверхностная пленка, бульон прозрачен, на дне пробирки через 24 ч организуется осадок; для биовара mitis - диффузное помутнение среды с образованием осадка, для биовара intermedius - тонкое гранулярное помутнение с последующим оседанием гранул на дно пробирки.

На кровяном агаре можно наблюдать гемолиз эритроцитов (кроличьих и крупного рогатого скота) при росте биовара mitis, гемолиз только кроличьих эритроцитов при росте биовара gravis и отсутствие гемолиза при росте биовара intermedius. Однако только биовар intermedius обладает липофильностыо - способностью усиливать рост на среде с 0,3% твина - 80.

Морфология клетки

Для C.diphtheriae характерен значительный полиморфизм - разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, палочки, овоида и т.п. Клетки C.ulcerans и C.pseudotuberculosis чаще всего имеют овоидную форму. На средах КТА овоидную форму часто приобретают токсигенные C.diphtheriae. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V, иногда - "китайские иероглифы". Подобную форму клетки приобретают при делении. Возможно параллельное расположение клеток, что особенно характерно для C.pseudodiphtheriticum и C.pseudotuberculosis.

При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина (метахроматические гранулы, тельца Бабеша-Эрнста). Описано сродство волютина к метиленовому синему (окраска по Лёффлеру), поэтому при обработке этим красителем гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. В бактериологической практике окраску по Граму не используют, поскольку клетки C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке как грамотрицательные микроорганизмы. При окраске по Нейссеру, которую также редко используют, клетки C.diphtheriae окрашиваются в желтый цвет с зернами волютина (на концах клетки) темно-коричневого цвета, иногда с синим оттенком.

Ферментативная активность

Ферментативная активность коринебактерий изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу и крахмал (табл.1). C.diphtheriae продуцируют фермент цистиназу, отсутствует продукция фермента уреазы, разлагают глюкозу, крахмал (биовар gravis), не разлагают сахарозу. Биовар mitis не разлагает крахмал. C.diphtheriae способны восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты).

Токсигенные свойства

C.diphtheriae, вызывающие заболевание дифтерией, обладают токсигенными свойствами. Основными генами патогенности C.diphtheriae, отвечающими за токсинообразование, являются ген дифтерийного токсина - tox и регуляторный ген - dtxR. 55-65% токсигенных C.diphtheriae, циркулирующих в период спорадической заболеваемости дифтерией, имеют изменения (мутации) в этих генах, некоторые из них приводят к повышению уровня токсинообразования. Подобные изменения характеризовали большинство штаммов C.diphtheriae, распространенных в 90-е годы во время эпидемии дифтерии в России и вызвавшие тяжелые формы клинического течения заболевания.

Уровень токсинообразования штаммов C.diphtheriae биовара gravis в два-четыре раза превышал уровень токсинообразования биовара mitis, вызывая более тяжелое клиническое течение дифтерии в период последней эпидемии. Также, начиная с 90-х годов прошлого столетия, биовар gravis имеет доминирующее распространение среди токсигенных C.diphtheriae, в то время как среди нетоксигенных C.diphtheriae доминирующее распространение имеет биовар mitis. От 2,0 до 20,0% этой группы в различные периоды эпидпроцесса составляли штаммы, несущие "молчащий" ген дифтерийного токсина (tох-ген), не способный к экспрессии дифтерийного токсина, так называемые нетоксигенные токснесущие штаммы C.diphtheriae биовара mitis, эпидемиологическое значение которых до конца не изучено. Для циркуляции C.diphtheriae характерна периодическая смена доминирующего биовара, которая, как правило, совпадает с началом интенсификации эпидпроцесса.

В период спорадической заболеваемости сокращена циркуляция токсигенных C.diphtheriae, вместе с тем циркуляция нетоксигенных остаётся на высоком уровне.

Несвоевременное выявление носителей токсигенных C.diphtheriae бактериологическим методом приводит к "скрытому" распространению возбудителя дифтерии и возникновению новых очагов дифтерийной инфекции.

4. Требования к взятию и транспортированию материала для бактериологической диагностики дифтерии


Эффективность проведения бактериологического исследования в значительной степени зависит от своевременного правильного взятия материала и соблюдения сроков доставки его в бактериологическую лабораторию.

Для взятия материала используют коммерческие стерильные сухие ватные (или дакроновые) тампоны, также возможно их приготовление в лабораторных условиях с учетом требований нормативно-методической документации. Тампоны должны иметь форму "капли", а не "веретена".

Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее чем через 2 ч после еды, а также до применения полоскания или других видов лечения. Взятие материала осуществляют при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с участков ротоглотки - миндалин, дужек мягкого неба, небного язычка, при необходимости - с задней стенки глотки. При наличии налетов патологический материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят глубоко сначала в один, а потом в другой носовой ход, собирая материал со стенок и перегородки носа, при этом не касаясь крыльев носа снаружи.

При дифтерии других локализаций (глаза, уши, кожа, раны, гениталии и пр.) помимо материала из пораженных участков забирают материал из ротоглотки и носа. При показаниях к обследованию на дифтерию и одновременном наличии пораженных слизистых и кожи в углу рта ("заеды") обследование этих участков проводят отдельным тампоном и параллельно берут материал из ротоглотки и носа.

При прямой ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. В случаях оперативного вмешательства для бактериологического исследования следует брать слизь из интубационной трахеотомической трубки.

При взятии материала с пораженного участка кожи необходимо протереть его поверхность промокательными движениями стерильной марлевой салфеткой или тампоном, смоченными стерильным физиологическим раствором, осторожно приподнять или отодвинуть струпы и корочки. После этого тампоном, предназначенным для взятия материала на дифтерию, взять секрет с пораженного участка. Одновременно забирают материал из ротоглотки и носа.

При постмортальном исследовании для выявления возбудителя дифтерии материал следует брать с миндалин, гортани и полости носа (слизь, пленки), при редких локализациях - со слизистой пищевода и желудка. Учитывая, что дифтерия является токсикоинфекцией, другие органы (сердце, печень и пр.) обследуют только для выявления токсических поражений.

Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее чем через 3 ч после взятия материала. В холодное время года для предотвращения замерзания исследуемый материал доставляют в бактериологическую лабораторию в сумках-термосах.

При невозможности доставки исследуемого материала в баклабораторию в установленные сроки (не позднее 3 ч) или проведения обследования в ЛПО во второй половине дня материал из ротоглотки (зева) и носа засевают "площадкой" с последующим рассевом на одну чашку Петри с питательной средой, разделенной пополам ("чашечный метод"). После этого посевы помещают в термостат при 37 °С до утра следующего дня, после чего доставляют в сумках-термосах в баклабораторию (с указанием времени посева материала). При редких локализациях посев материала из каждого пораженного участка осуществляют на отдельную чашку Петри с питательной средой.

Медицинский персонал ЛПО должен проходить инструктаж в баклаборатории о правилах взятия и посева материала на питательные среды.

При невозможности организовать посев материала "чашечным методом" допускается засевать материал в пробирки с транспортной средой для сохранения и подращивания возбудителя дифтерии, которая готовится в лабораторных условиях согласно нормативно-методической документации. Не допускается использование коммерческих транспортных сред, предназначенных для исследования на микрофлору ротоглотки и носа, в связи с тем, что состав этих сред не удовлетворяет условиям культивирования возбудителя дифтерийной инфекции, что приводит к потере патологического материала.

В случае использования транспортной среды, приготовленной в лабораторных условиях, согласно нормативной документации, материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокала. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки, так как после подращивания в термостате при 37 °С на утро следующего дня материал доставляется в баклабораторию для последующего посева на чашки Петри с селективной питательной средой.

Незасеянные (чистые) чашки Петри с питательной средой и пробирки с транспортной средой доставляются в ЛПО из баклабораторий. Хранение питательных сред в ЛПО осуществляется в холодильнике при 4-6 °С; чашки со средой - не более трех дней; пробирки с транспортной средой - не более 10 дней. Перед взятием и посевом материала их необходимо достать из холодильника и согреть до комнатной температуры. При невозможности доставки материала в баклабораторию круглосуточно ЛПО оснащаются термостатами. В стационаре взятие патологического материала проводят круглосуточно, используя "чашечный метод".

Исследуемый материал из ротоглотки и носа, собранный сухими ватными тампонами и помещенный в пробирки (не менее двух пробирок от одного лица, при редких локализациях добавляются дополнительные пробирки), или материал, засеянный в пробирки с транспортной средой (также не менее двух пробирок от одного лица), или материал из ротоглотки и носа, а также из редких мест локализации, засеянный "чашечным методом", должен быть четко пронумерован и иметь сопроводительную документацию. Пробирки с материалом от одного лица скреплены вместе.

В сопроводительном документе указывают: фамилию, имя, отчество, возраст, адрес обследуемого лица, название учреждения, направляющего материал, локализацию взятия материала (нос, зев, кожа и др.), дату и время взятия материала, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, с профилактической целью).

5. Организационно-методическая работа

1. Медицинским работникам лечебно-профилактических организаций (ЛПО), ответственным за взятие и транспортирование материала при обследовании на дифтерию, необходимо согласовывать методику взятия материала, условия транспортирования и возможности применения транспортной среды с врачами-бактериологами, проводящими эти исследования.

2. Медицинским работникам ЛПО, допущенным к взятию и посеву материала, следует проходить инструктаж не реже 1 раза в год в баклаборатории, проводящей исследования на дифтерию.

3. Врачам-бактериологам ЛПО и ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации следует повышать квалификацию на курсах тематического усовершенствования по лабораторной диагностике дифтерии не реже 1 раза в три года.

4. Методическую помощь по вопросам взятия, транспортирования и лабораторной диагностики дифтерии осуществляют региональные центры по мониторингу за возбудителями инфекционных и паразитарных болезней II-IV групп патогенности (на базе ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации - далее Региональные центры по мониторингу) и Референс-центр по мониторингу за дифтерией (на базе ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора - далее Референс-центр).

5. Бактериологические лаборатории ФБУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора в субъектах Российской Федерации направляют все выделенные токсигенные и выборочно нетоксигенные штаммы C.diphtheriae, C.ulcerans, C.pseudotuberculosis, а также штаммы с атипичными свойствами в Референс-центр для реидентификации (верификации) по адресу: 125212, г.Москва, ул.Адмирала Макарова, 10.

6. Бактериологические лаборатории Региональных центров по мониторингу и Референс-центр осуществляют внешний контроль качества лабораторных исследований на дифтерию, проводимых в бактериологических лабораториях субъектов Российской Федерации.

6. Бактериологическое исследование

6.1. Порядок проведения бактериологического исследования


Первый день. Посев материала

Материал для исследования из ротоглотки (зева), носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред - КТА или Клауберг II, разлитых в чашки Петри ("чашечный метод посева") (рис.1).

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности (МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции) чашки среды для посева материала из ротоглотки (зева), а вторую - для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других пораженных мест добавляют еще одну чашку (все чашки маркируются). Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал тщательно втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции1 смМУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции у края чашки, стараясь оставить весь патологический материал на поверхности формируемой "площадки". Формирование такой "площадки" является обязательным, что позволяет сохранить исследуемый материал, находящийся на тампоне. Дальнейший рассев исследуемого патологического материала осуществляют этим же тампоном, не отрывая тампон от поверхности питательной среды, засевая оставшуюся поверхность МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции чашки, что позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно с чашки первичного посева. Такой метод сохраняет весь патологический материал на поверхности питательной среды и позволяет работать с отдельными изолированными колониями, исключая этап накопления на агаровом косяке чистой культуры, что сокращает длительность проведения исследования на одни сутки.

Засеянные чашки с плотной питательной средой или пробирки с транспортной средой помещают в термостат для инкубации при 37 °С.

Высев из транспортной среды производят описанным выше способом на следующие сутки, используя дифференциально-диагностическую плотную питательную среду, тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Чашки со средой предварительно согревают при комнатной температуре или в термостате при 37 °С (15-20 мин). Если на поверхности чашки со средой есть конденсат, то ее подсушивают на крышке, повернув чашку вверх дном. Нельзя использовать для посева материала "охлажденные" чашки с питательной средой.

Второй день

1. Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 ч после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 ч, т.е. во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

2. Чашки с колониями, "подозрительными" на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. "Подозрительные" колонии на кровяно-теллуритовых средах (КТА) через 24 ч роста - темно-серого или серо-черного цвета, выпуклые, округлой формы, непрозрачные, с ровными краями или с легкой изрезанностью края или радиальной исчерченностью, мягкой, маслянистой консистенции; через 48 ч окончательно формируется типичная морфология (архитектоника) колоний - серо-черного или черного цвета с металлическим оттенком ("цвет мокрого асфальта"), непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром или выпуклые, округлой формы, гладкие с ровными краями и мягкой консистенции (S-форма) или шероховатые, с радиальной исчерченностью (напоминающие форму "маргаритки"), с приподнятым центром (R-форма). Иногда крошащиеся при прикосновении петлей.

3. Микроскопию препаратов - мазков из "подозрительных" колоний можно не проводить, так как все эти колонии подлежат обязательному изучению в пробе на токсигенность и в пробе Пизу.

4. Из "сомнительных" колоний готовят препараты - мазки. В препаратах-мазках, как "подозрительных", так и "сомнительных" колоний клетки C.diphtheriae из культуры, выросшей на средах первичного посева с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизмов, но дает возможность при обнаружении коринеформных микроорганизмов предположительно отнести их к роду Corynebacterium и подвергнуть дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек) дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

5. В случае роста "подозрительных" по морфологии колоний, похожих на колонии коринебактерий, необходимо сразу через 24 ч роста приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и "необожженной" петлей - на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления чистой культуры.

6. При невозможности снять МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции колонии в первые 24 ч роста для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии. Посев на скошенный агар исключается и в дальнейшем используется культура, выросшая через 24 ч в пробирке с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 ч роста колонии имеют небольшие размеры и материала МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности C.diphtheriae, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5-7 однотипных колоний в одну бляшку. При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточного количества и малого размера колоний, выросших через 24 ч, изучают, смешивая однотипные по морфологии и размеру колонии в нескольких бляшках и, не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с пробами на токсигенность и Пизу помещают в термостат.

7. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 ч и просматривают их повторно через 48 ч роста первичного материала (на третьи сутки).

8. Предварительный ответ о выявлении C.diphtheriae может быть выдан при наличии множественного роста однотипных "подозрительных" колоний на чашках первичного посева после 24 ч инкубации. Выявляют наличие фермента цистиназы (через 3 ч) и определяют наличие фермента уреазы (через 30 мин) путем внесения в пробирки большого количества колоний (до 5-6).

Третий день

1. Через 24 ч, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ о выделении C.diphtheriae токсигенных. При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности чашки инкубируют еще 24 ч.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (глюкоза, сахароза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

3. Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС) повторно через 36-48 ч инкубации в термостате. При наличии "подозрительных" колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенном сывороточном агаре, если эти процедуры не были выполнены через 24 ч роста первичного материала.

4. Если вырастает только одна колония через 48 ч роста на чашках первичного посева, ее засевают на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу или с бляшки через 48 ч роста в пробе на токсигенность, или через 24 ч роста в случае выявления токсигенных свойств идентифицируемой культуры.

5. При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

6. При отсутствии роста микроорганизмов на "площадках" в чашках первичного посева через 48 ч инкубации в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил проведения бактериологического исследования (взятия, транспортирования, посева и культивирования исследуемого материала и качества питательных сред для первичного посева).

Четвертый день (или пятый)

1. При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 ч инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной), если эта процедура не была сделана ранее.

3. Повторно (через 48 ч) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 ч после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, только на 4-5 сутки культуру идентифицируют как C.diphtheriae нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.

4. При выделении токсигенных C.diphtheriae на 3-4 сутки от начала исследования дополнительно ответ о биохимических свойствах может быть выдан на 4-5 сутки (через 72 или 96 ч с момента первичного посева исследуемого материала).

6.2. Бактериологическое заключение

1. Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

2. Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные морфологические, культуральные и биохимические свойства (отсутствие ферментации сахарозы, ферментация глюкозы и крахмала или неферментация крахмала) позволяют заключить, что выделенная культура является C.diphtheriae, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

3. При выделении C.pseudodiphtheriticum (ложнодифтерийной палочки Гофмана) или других дифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.

4. При наличии линий преципитации (чаще "размытых" в виде "облачка"), идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду C.ulcerans, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для C.ulcerans, нетоксигенный вариант, бактериологический ответ считают отрицательным.

5. C.pseudotuberculosis идентифицируется по положительной реакции в пробе на уреазу. Тест восстановления нитратов в нитриты у этих микроорганизмов является вариабельным признаком, поэтому дифференциацию от C.ulcerans проводят по крахмалу (C.pseudotuberculosis не способны разлагать крахмал - отрицательный результат). Необязательный тест для практических бактериологов - для дифференциальной диагностики C.ulcerans и C.pseudotuberculosis вводят дополнительную пробу ферментации трегалозы и гидролиз желатина. Возможно выделение токсигенных С.pseudotuberculosis.

6. При выделении C.ulcerans и C.pseudotuberculosis необходимо подтверждение подобной идентификации в Референс-центре ФБУН МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского Роспотребнадзора, чтобы исключить ошибки при возможном выделении C.diphtheriae.

7. Предварительный ответ при обследовании с диагностической целью и по эпидпоказаниям может быть выдан при наличии множественного роста однотипных "подозрительных" колоний на чашках первичного посева после 24 или 48 ч инкубации (на 2-3 сутки). Выявляют наличие фермента цистиназы и отсутствие фермента уреазы путем внесения в пробирки большого количества колоний. Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.

При нативной микроскопии (по просьбе инфекционистов) требуется дополнительный материал на тампонах из ротоглотки и носа. Однако чаше всего микроорганизмы в виде "палочек" не обнаруживают, что делает этот способ практически не пригодным.

6.3. Схема бактериологического исследования

1 день

Посев исследуемого материала на селективную дифференциально-диагностическую или, при необходимости, в транспортную среду. Инкубирование в термостате при 37 °С.

2 день (24 часа)

1. Изучение выросших колоний, при возможности - постановка пробы на токсигенность, цистиназу и посев культуры на скошенный сывороточный агар.

2. При использовании транспортной среды необходимо произвести пересев на селективную дифференциально-диагностическую среду.

3. При множественном росте, в случае необходимости, можно провести исследования для выдачи предварительного ответа - дополнительные пробы Пизу и Заксе.

3 день (48 часов)

1. Учет результатов проб на токсигенность и на цистиназу, поставленных во второй день исследования. В случае наличия специфических линий преципитации и при положительной пробе Пизу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

2. Посев чистой культуры, выделенной во второй день исследования, на среды Гисса для изучения биохимических свойств (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

3. Повторный просмотр (через 48 ч) чашек первичного посева визуально или с помощью МБС. Постановка проб на токсигенность, цистиназу и отсев колоний на скошенный сывороточный агар.

4. В случае использования транспортной среды, ход исследования см. начиная с п.1 второго дня и далее по схеме.

5. Выдача бактериологического ответа об отсутствии коринебактерий дифтерии.

6. При обнаружении у исследуемой культуры фермента цистиназы, отсутствии фермента уреазы, можно выдать предварительный ответ о выделении дифтерийного микроба.

4 день (72 часа)

1. Учет токсигенных свойств культуры, выделенной в 3 день исследования (через 48 ч роста первичного посева), при обнаружении специфических линий преципитации выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии. Определяют биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал, мочевина).

2. Учет биохимических свойств культуры (токсигенной или нетоксигенной), выделенной во второй день исследования (через 24 ч инкубации первичного посева).

3. Выдача бактериологического ответа о выделении нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта и дополнительного ответа о биохимических свойствах токсигенных коринебактерий дифтерии, выделенных ранее.

5 день (96 часов)

1. Выдача бактериологического ответа о выделении токсигенных или нетоксигенных коринебактерий дифтерии с указанием биохимического варианта (в случае 48 ч инкубации первичного посева и 48 ч проявления или не проявления специфических линий преципитации в пробе на токсигенность).

7. Методики идентификации возбудителя дифтерийной инфекции

7.1. Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации в геле


В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (модифицированный тест Элека с бумажными полосками и тест Фельдмана с соавт. с бумажными дисками) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии со среды первичного посева или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными на скошенной сывороточно-агаровой среде или после рассева на КТА чистыми культурами.

Для постановки пробы на токсигенность необходимо иметь: стерильные чашки Петри с ровным дном (стеклянные или одноразовые пластиковые), питательную среду - сухую коммерческую питательную среду для определения токсигенности или агар Мартена, нормальную сыворотку крови крупного рогатого скота (СКРС), стерильные полоски из фильтровальной бумаги размером 0,7 смМУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции8,0 см, или бумажные диски диаметром 0,6 см, очищенный ферментолизом и специфической сорбцией дифтерийный антитоксин (в дальнейшем именуется антитоксин), при отсутствии которого в исключительных случаях можно использовать противодифтерийную антитоксическую сыворотку лошадиную, лечебную (в дальнейшем именуется антитоксическая сыворотка). Лучше использовать коммерческие или приготовленные в лаборатории бумажные диски, пропитанные антитоксином. Обязательным является использование контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии биовара gravis 24-48-часового роста.

7.1.1. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных дисков с антитоксином (по Фельдману с соавт.)


Приготовление чашек для постановки пробы на токсигенность


Питательный агар для определения токсигенности целесообразно разливать в пробирки по 10 мл (количество, необходимое для приготовления одной чашки). При большом объеме работы питательный агар разливают во флаконы по 70-80 мл (на 7-8 чашек пробы на токсигенность). Питательный агар следует расплавлять только 1 раз; многократное плавление ухудшает свойства среды. Питательный агар расплавляют в водяной бане при 90 °С, тотчас же вынимают из бани, охлаждают до 50 °С и добавляют 20% сыворотки крупного рогатого скота. Так, к 10 мл питательного агара добавляют 2 мл сыворотки крупного рогатого скота (СКРС), перемешивают и выливают, соблюдая правила асептики, в стерильную чашку Петри, распределяют среду по дну осторожным вращением чашки, не допуская "вспенивания" - появления неровностей на поверхности среды.

Чашку подсушивают в термостате при 37 °С в течение 15-20 мин, при открытой крышке, повернув ее вверх дном, до нанесения бумажных дисков с антитоксином на поверхность среды. Чашки с питательной средой недопустимо пересушивать.

В редких случаях, когда на чашках первичного посева вырастают единичные колонии (не более 8), токсигенные свойства которых надлежит изучить, возможно использование полистироловых чашек Петри диаметром 4,5 см. Количество питательного агара и СКРС уменьшается (3,2 мл питательного агара 1,8%+0,8 мл СКРС).

Чашки со средой для определения токсигенности хранить не рекомендуется.

Приготовление бумажных дисков с дифтерийным антитоксином


Диски из плотной фильтровальной бумаги нарезают диаметром 6 мм, стерилизуют автоклавированием при 2 атм. в течение 20-30 мин, высушивают и пропитывают антитоксином, разведенным в 1 мл дистиллированной воды (500 МЕ в 1 мл). Достаточно 1 мл антитоксина для приготовления 80-100 дисков, 1 диск содержит (5±1) МЕ дифтерийного антитоксина. Далее диски подсушивают в термостате (соблюдая асептические условия) в течение 18-24 ч. Готовые диски помещают в стерильный флакон иди пробирку с силикагелем или другим гигроскопическим веществом и сохраняют в холодильнике при 4-6 °С.

Постановка пробы на токсигенность


На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают четыре бумажных диска с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 "бляшек": две "бляшки" - контрольного штамма и три - испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две "бляшки" из изолированных колоний и одну - из смеси 3-6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг других дисков с антитоксином). Все пять "бляшек" располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,7 см от его края. Диаметр каждой "бляшки" 0,6-0,7 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 "бляшек" с культурами (8 "бляшек" контрольных и 12 "бляшек" испытуемых). Бумажные диски расставляют на поверхности сывороточно-агаровой среды на максимально удаленном расстоянии между дисками, чтобы не произошло перекрестных реакций (рис.3).

Чашки с посевами помещают в термостат при 37 °С.

Учет результатов


Результат реакции учитывают через 18-24 часа, а также - через 48 ч. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсигенной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 ч, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18-24 ч. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды, проверки чистоты контрольного штамма, или улучшения его фенотипических свойств при выращивании на кровяном агаре, или замены контрольного штамма.

7.1.2. Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием бумажных полосок (по модифицированному тесту Элека)


Чашки для постановки пробы на токсигенность этим методом готовят так же, как при работе с бумажными дисками (чашки диаметром 4,5 см не используют). В центр чашки на поверхность застывающего агара обожженным пинцетом помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную антитоксином (или в редких случаях при отсутствии антитоксина используют антитоксическую лечебную лошадиную сыворотку). Чашку с бумажной полоской с антитоксином подсушивают в термостате при 37 °С в течение 15-20 мин при открытой крышке, повернув ее вверх дном. Приготовленные таким способом чашки не подлежат хранению.

Приготовление бумажных полосок с антитоксином

Полоски фильтровальной бумаги нарезают размером (0,7х8,0) см, заворачивают по 2-4 штуки в пакетик и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. в течение 30 мин. Пакетики с бумажными полосками хранят в стерильной чашке Петри до 3 недель. Важным является сохранение ровных краев полоски и отсутствие грифельной черты при рисовании их на фильтровальной бумаге.

Перед постановкой пробы на токсигенность содержимое ампулы с антитоксином растворяют в 1 мл стерильного физиологического раствора, переносят в стерильную пробирку и указывают на ней данные этикетки (растворенный антитоксин хранят при температуре 4-6 °С не более 10 дней). Фильтровальные бумажки обожженным пинцетом помещают в стерильную чашку Петри, где на каждую полоску наносят 0,125 мл антитоксина, содержащего 500 МЕ в 1 мл.

Постановка пробы на токсигенность с бумажными полосками с антитоксином

Культуру засевают в виде "бляшек" диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 "бляшек" (по 5 "бляшек" с каждой стороны полоски). Из них 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4 - контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных "бляшек" и 4 - испытуемых. Материал от одного анализа засевают параллельными "бляшками" по обе стороны полоски с антитоксином (рис.4А).

Чашки с посевом помещают в термостат при 37 °С.

Учет результатов

Результат учитывают через 18-24 ч и 48 ч от начала постановки пробы на токсигенность. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма, чаще всего это может произойти через 48 ч, через 24 ч намечается только тенденция к слиянию. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации (рис.4Б), что практически не наблюдается при использовании антитоксина, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Если через 18-24 ч от момента постановки пробы на токсигенность у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции. Необходимо проверить качество питательной среды или улучшить фенотипические свойства контрольного штамма, пассируя его на кровяной агаровой среде, или заменить контрольный штамм.

Оценка результатов реакции пробы на токсигенность при использовании бумажных дисков или полосок с антитоксином


Доступ к полной версии этого документа ограничен

Ознакомиться с документом вы можете, заказав бесплатную демонстрацию систем «Кодекс» и «Техэксперт».

Что вы получите:

После завершения процесса оплаты вы получите доступ к полному тексту документа, возможность сохранить его в формате .pdf, а также копию документа на свой e-mail. На мобильный телефон придет подтверждение оплаты.

При возникновении проблем свяжитесь с нами по адресу spp@kodeks.ru

МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции

Название документа: МУК 4.2.3065-13 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции

Номер документа: 4.2.3065-13

Вид документа: МУК (Методические указания по методам контроля)

Принявший орган: Главный государственный санитарный врач РФ

Статус: Действующий

Опубликован: официальное издание

М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2013 год

Дата принятия: 14 июля 2013

Информация о данном документе содержится в профессиональных справочных системах «Кодекс» и «Техэксперт»
Узнать больше о системах