ГОСТ Р 55576-2013 Корма и кормовые добавки. Метод качественного определения регуляторных последовательностей в геноме сои и кукурузы (Издание с Изменением N 1)

     10 Постановка ПЦР и проведение амплификации с гибридизационно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени (Real Time PCR)

10.1 Для выявления ГМ сои и ГМ кукурузы методом Real Time PCR используют "ПЦР-комплект" по 5.2.

10.1.1 Постановка ПЦР

Размораживают необходимое количество пробирок с ПЦР-смесью-1 (ГМ соя/ГМ кукуруза). Перемешивают на встряхивателе и сбрасывают капли с помощью кратковременного центрифугирования в течение 1-3 с.

Для проведения одной реакции в пробирку вносят 10 мм ПЦР-смеси-1, 5 мм ПЦР-буфера и 0,5 мм полимеразы (TaqF). Смесь перемешивают на встряхивателе, осаждая кратковременным центрифугированием, затем вносят по 15 мм смеси в микропробирки вместимостью 0,2 см. Используя наконечник с аэрозольным барьером, в подготовленные пробирки добавляют по 10 мм ДНК испытуемых образцов, избегая попадания универсального сорбента в реакционную смесь.

Ставят контрольные реакции амплификации:

- отрицательный контрольный образец (К-) - вместо ДНК-пробы вносят в пробирку 10 мм ТЕ-буфера;

- положительный контрольный образец (К+) - вносят в пробирку 0,01 см ПКО ГМ соя/ПКО ГМ кукуруза.

Общий объем реакции - 25 мм, объем ДНК-пробы - 10 мм.

(Измененная редакция, Изм. N 1).

10.1.2 Проведение амплификации и детекции флюоресцентного сигнала

Программа амплификации:

- денатурация первичная 95°С - 15 мин;

- циклирование 95°С - 10 с, 59°С - 60 с.

Цикл повторяют 40 раз.

Флюоресценцию для определения ГМ сои измеряют при температуре 59°С на запрограммированных на приборе каналах FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange, Cy5/Red согласно инструкции по эксплуатации.

Флюоресценцию для определения ГМ кукурузы измеряют при температуре 59°С на запрограммированных на приборе каналах FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange прибора согласно инструкции по эксплуатации.

10.2 Анализ результатов амплификации

10.2.1 Режим анализа результатов амплификации приведен в таблице 1.

Таблица 1

Полученные в ходе испытания данные - кривые накопления флюоресцентного сигнала - анализируют по нескольким каналам детекции с помощью программного обеспечения прибора.

10.2.2 Результаты интерпретируют на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на соответствующем уровне пороговой линией на графике зависимости интенсивности флюоресценции от количества циклов, что соответствует значениям порогового цикла "Ct".

Учет результатов испытания следует начинать с результатов амплификации ДНК контрольных образцов.

Для положительного контроля амплификации по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange и Cy5/Red для ГМ сои и по каналам FAM/Green, JOE/Yellow, ROX/Orange для ГМ кукурузы должны присутствовать значения порогового цикла "Ct".

Для отрицательного контрольного образца и отрицательного контроля амплификации значения порогового цикла "Ct" по всем каналам должны отсутствовать.