МУК 4.2.2315-08
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
Серологические методы в диагностике холеры
Дополнение к МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры"
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (Ю.М.Федоров, Н.Я.Жилина); ФГУЗ "Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт" (Ю.М.Ломов, Л.С.Подосинникова, Б.Л.Мазрухо, Э.А.Москвитина, Л.М.Веркина, Н.Р.Телесманич, В.В.Агафонова); ФГУЗ "Противочумный центр" (Ю.С.Королев, С.М.Иванова); ФГУЗ "Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт" (В.Н.Савельев, И.В.Савельева); ФГУЗ "Российский научно-исследовательский противочумный институт "Микроб" (В.П.Топорков); ФГУЗ "Причерноморская противочумная станция" (Г.В.Гальцева); Управлением Роспотребнадзора по г.Москве (Л.А.Цвиль, Г.М.Маненкова, Т.И.Шестиперова).
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 6 декабря 2007 г. N 3).
3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 18 января 2008 г.
4. ВВЕДЕНЫ в дополнение к Методическим указаниям МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры".
1. Область применения
1.1. Настоящий методический документ "Серологические методы в диагностике холеры" разработан в дополнение к методическим указаниям МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры" в части, касающейся организации и проведения серологической диагностики холеры у людей.
1.2. Документ предназначен для специалистов управлений по субъектам Российской Федерации, центров гигиены и эпидемиологии в субъектах Российской Федерации и противочумных учреждений Роспотребнадзора, лечебно-профилактических учреждений.
2. Нормативные ссылки
2.1. СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".
2.2. СП 1.3.2322-08 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".
2.3. СП 1.3.2518-09 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней". Доп. и изм. 1 к СП 1.3.2322-08.
2.4. СП 3.3.2.1248-03 "Условия транспортирования и хранения медицинских иммунобиологических препаратов".
2.5. СП 3.1.1.2521-09 "Профилактика холеры. Общие требования к эпидемиологическому надзору за холерой на территории Российской Федерации".
2.6. МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры".
2.7. МР "Метод микрообъемной реакции агглютинации для идентификации холерных вибрионов".
3. Значение серологических методов в диагностике холеры
Серологические методы в диагностике холеры используют как с целью выявления противохолерных антител в крови больных (переболевших) и вакцинированных, так и в идентификации возбудителя. Последние достаточно полно описаны в МУК 4.2.2218-07 "Лабораторная диагностика холеры" и в настоящем документе приводится описание лишь новых реакций, упрощающих видовую идентификацию холерных О1 и О139 вибрионов в РКОА (реакция коагглютинации) или ориентировочную оценку эпидемической значимости посредством выявления липазной активности в РАО.
Что же касается выявления противохолерных антител у людей, то значимость этого факта, величина и динамика их титров рассматриваются и оцениваются в сочетании с клинико-эпидемиологической ситуацией и характеристикой обследуемого контингента.
Диагностика первых случаев холеры является наиболее ответственной и сложной и должна быть максимально обоснованной, что связано с возможностью ошибок при сходных с холерой состояниях. Следует иметь в виду, что официальная регистрация первых случаев холеры влечет за собой, помимо чисто медицинских мер, введение ряда ограничительных мероприятий, требующих больших экономических затрат.
Серологическое обследование людей на холеру имеет, как правило, дополнительное значение. Но в отдельных случаях, при проведении оперативного и ретроспективного эпидемиологического анализа, серопозитивные результаты в структуре критериев диагностики холеры могут иметь решающее значение.
Серологическое обследование позволяет подтвердить диагноз у больных с атипичной клиникой холеры при отсутствии выделения возбудителя, в т.ч. при обследовании на фоне лечения антибиотиками, или исключить диагноз холеры, поставленный на основании одних клинических данных. Серологический анализ является также существенным методом ретроспективной диагностики холеры. В ряде случаев иммунологические тесты дополняют клинико-эпидемиологические данные и позволяют установить или исключить факт внутрибольничного заражения холерой.
Определение токсиннейтрализующих антител в сыворотке людей позволяет сделать заключение об эпидемичности (токсигенности) штаммов холерных вибрионов О1 или О139 серогрупп, циркулирующих в очаге холеры, что играет важную роль в определении объема противохолерных мероприятий. При этом целесообразно дифференфицировать серопозитивные результаты как следствие холерной инфекции или иммунизации холерной вакциной.
Для серологической диагностики холеры используют различные иммунологические реакции, выявляющие в сыворотке крови больных, вибриононосителей и реконвалесцентов, а также вакцинированных специфические антитела: агглютинины, антитоксины и вибриоцидные антитела.
У больных холерой специфические антитела, как правило, выявляются на 5-7 день от начала заболевания.
Наиболее достоверные данные могут быть получены при исследовании парных сывороток с интервалом 7-10 дней и/или при использовании системы иммунологических реакций.
Тактика применения иммунологических тестов зависит от конкретных целей и задач серологического обследования людей на холеру, которое должно проводиться в основном по эпидемиологическим показаниям и с использованием комплекса реакций. Выбор схем исследования сывороток людей на холеру также определяется целями и задачами обследования больных, вибриононосителей, переболевших, контактных с ними и др.
4. Методы выявления противохолерных антител
Специфические агглютинины к холерным вибрионам О1 серогруппы можно выявить путем постановки объемной реакции агглютинации (РА), в двухкомпонентной реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием антигенного поливалентного О1 холерного диагностикума, а также при постановке трехкомпонентной реакции нейтрализации антигена (РНАг) с иммуноглобулиновым холерным диагностикумом. Реакция пассивной гемагглютинации с использованием энтеротоксического холерного диагностикума (РПГА) позволяет выявлять иммуноглобулины к токсигенным штаммам холерных вибрионов О1 и О139 серогрупп - антитоксины. С помощью реакции вибриоцидных антител (РВА) можно выявлять вибриоцидные антитела.
4.1. Подготовка проб
Для постановки серологических реакций кровь берут из локтевой вены в объеме 1-5 мл, при отсутствии такой возможности - из пальца. В последнем случае исследование ведут микрометодом с учетом возможности получения результатов в 2-4 раза ниже, чем при постановке серологических реакций макрометодом.
После свертывания сгусток отслаивают от стенки пробирки стерильной стеклянной палочкой или платиновой петлей. Пробирки сохраняют в холодильнике или транспортируют в лабораторию охлажденными (в сумке-холодильнике, термосе и т.п.). В лаборатории сыворотку инактивируют при температуре (56,0±0,5) °С в течение 30 мин. Если кровь забирают в день постановки реакции, то пробирки со свернувшейся кровью необходимо центрифугировать 10-15 мин при 3000 оборотов в минуту. Кровь из пальца берут в объеме 0,4 мл и вносят в стерильный пенициллиновый флакон или пробирку с 1,6 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (1:5).
При отсутствии возможности исследовать сыворотку немедленно, ее сохраняют в ампулах при температуре (4,0±0,5) °С.
4.2. Определение агглютининов в сыворотке крови
4.2.1. Реакция агглютинации (РА) с живыми культурами
Агглютинины в крови больных холерой обнаруживаются, начиная с 6-9 дня болезни в титрах 1:40-1:80, достигая к 12-16 дню максимальных значений 1:640-1:1280. Диагностическими считаются титры агглютинации в разведении 1:40 и выше или их 4-кратное нарастание в парных сыворотках.
Работу с живыми культурами холерных вибрионов осуществляют с соблюдением требований действующих санитарных правил по безопасности работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности).
Методика постановки реакции агглютинации (РА) в макрообъеме
Исследуемую сыворотку титруют в 1%-й пептонной воде рН 7,5±0,1 в объеме 1 мл от 1:10 до 1:640. В качестве антигена используют 3-часовую бульонную культуру холерного вибриона, выделенного в данном очаге, или сыворотку исследуют в 3-х рядах с 3-часовыми бульонными культурами тест-штаммов холерных вибрионов О1 (сероваров Огава, Инаба) и О139 серогрупп. В пробирки с титрованной сывороткой вносят по 1 капле культуры-антигена и ставят на 1 ч в термостат при 37 °С, затем до утра в холодильник при температуре (4,0±0,5) °С, после чего отмечают результаты. Реакция сопровождается контролями антигена и сыворотки.
При определении титра реакции учитывают разведения с агглютинацией на 3-4 креста.
Методика постановки реакции агглютинации (РА) в микрообъеме
Материалы и оборудование.
Микропланшеты для иммунологических реакций с круглодонными лунками и прозрачными крышками.
Механические 1-, 4- и 8-канальные дозаторы с переменным объемом 50-200 мкл и соответствующие наконечники.
Кюветы (подносы) эмалированные, фаянсовые.
Стереомикроскоп типа МБС-10.
Культура холерного вибриона, выделенная в данном очаге, или тест-штаммы холерных вибрионов О1 (сероваров Огава и Инаба) и О139 серогрупп (допускается использование убитых культур).
Постановка реакции.
Реакция осуществляется в объеме 0,1 мл (100 мкл).
Готовят взвесь культуры (антигена) холерного вибриона, выделенного в данном очаге, или тест-штаммов холерных вибрионов О1 (сероваров Огава и Инаба) и О139 серогрупп в 3-4 мл 0,85%-го раствора хлорида натрия из 6-18-часовой агаровой культуры до концентрации 2х10 м.к. в 1 мл, что соответствует 10 ед. стандарта мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича.
Микропланшеты маркируют, надписывая карандашом с левой стороны номер исследуемой сыворотки, а сверху ее разведения от 1:5 до 1:640, номер штамма (живой или убитой культуры).
В лунки каждого ряда дозаторами разливают по 50 мкл 0,85%-го раствора хлорида натрия. Затем в 1-ю лунку вносят 50 мкл исследуемой сыворотки, инактивированной при 56 °С 30 мин, в разведении 1:5 и проводят двукратное ее разведение микропипеткой на 50 мкл, из последней лунки удаляют 50 мкл. Затем в каждую лунку вносят 50 мкл взвеси культуры-антигена в концентрации 2х10 м.к. в 1 мл. Реакция сопровождается контролями антигена (антигенов) и исследуемой сыворотки. Планшет накрывают крышкой и помещают в термостат при 37 °С на 2 ч.
Учет реакции.
Учет реакции проводят в косо проходящем свете под стереомикроскопом МБС-1, МБС-2 или МБС-10.
Реакцию оценивают по характеру агглютинации на дне лунки:
полная агглютинация: наличие на дне лунки рыхлой разорванной пленки, четких хлопьев на фоне темного поля;
неполная агглютинация: наличие нежной пленки и полиморфных комочков агглютината на темном фоне;
слабая агглютинация: наличие мелких хлопьев на фоне сероватого поля;
следы агглютинации: мелкие единичные хлопья на фоне мутной жидкости.
Реакцию оценивают отрицательно, когда в луночке вибрионы равномерно выстилают дно или собираются в "пуговку". Под микроскопом видно равномерное мелкозернистое поле без темных промежутков.
Положительной считают реакцию при наличии полной и неполной агглютинации.
При постановке реакции агглютинации в микрообъеме дополнительно предусматривают следующее:
планшеты помещают на поднос (фаянсовый, эмалированный). На дно подноса предварительно расстилают марлевую салфетку, смоченную дезинфицирующим раствором (3%-й раствор хлорамина, 3%-й раствор перекиси водорода с 0,5% моющего средства);
после внесения дозатором в каждую лунку 50 мкл взвеси живых культур холерных вибрионов в дозе 2х10
м.т./мл планшет накрывают крышкой и на подносе ставят в термостат при 37 °С на 2 ч;
для учета реакции поднос с планшетом переносят на лабораторный стол, затем планшет ставят на стеклянную подставку и оценивают характер реакции агглютинации в косо проходящем свете с помощью стереоскопического микроскопа (системы МБС);
при учете реакции крышку с планшета не снимают. В случае запотевания крышки ее меняют на другую, а запотевшую помещают в емкость с 3%-м раствором хлорамина;
после учета реакции крышку снимают, планшет и крышку складывают в кювет, заливают 3%-м раствором хлорамина, накрывают и оставляют на 24 ч. Разовые планшеты обеззараживают физическим способом - автоклавированием при 1,5 кгс/см
в течение 60 мин. Стеклянную крышку столика приспособления для косого освещения обрабатывают 70%-м спиртом.
4.2.2. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)
РПГА с диагностикумом эритроцитарным или полимерным холерным антигенным О1 или О139 предназначена для выявления полных антител в сыворотке крови. По чувствительности значительно превосходит реакцию агглютинации. Антитела в крови больных выявляются с 6-9 дня болезни в титрах 1:80-1:320, максимальных титров 1:640-1:1280 и более достигают к 12-16 дню. Диагностическими считаются титры агглютинации в разведении 1:80 и выше или 4-кратное нарастание титров антител в парных сыворотках.
Необходимые ингредиенты, методика постановки реакции в макро- и микрообъемах изложены в наставлении к диагностикуму холерному антигенному. Схемы методик постановки РПГА и РТПГА (реакция торможения пассивной гемагглютинации) представлены в прилож.6.1 и 6.2 (макрометод).
