МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ПОЛИЭДРОВ ВИРУСА ЯДЕРНОГО ПОЛИЭДРОЗА НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, НА РАСТИТЕЛЬНЫХ ОБЪЕКТАХ И В ВОЗДУХЕ ИММУНОФЛЮОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ*

_______________

* Разработали В.Л.Васильева, А.Л.Гураль, М.А.Дяченко, В.И.Трусов (КНИИЭИБ).

УТВЕРЖДЕНО 27.09.78 N 1921-78

Краткая характеристика препарата. Вирин-ЭНШ - вирусный энтомопатогенный препарат - вирусный инсектицид. Предназначается для борьбы с гусеницами непарного шелкопряда в лесах, садах, парках. Действующее начало препарата - полиэдры экспериментального штамма вируса ядерного полиэдроза, относящегося к группе бакуловирусов. Препарат - суспензия полиэдров в 50%-ном глицерине. Применяется методом авиа- или тракторного распыления.

Препарат вирин-ЭНШ и его активное начало не токсичны и не вызывают инфекционных заболеваний людей, домашних или диких животных. В эксперименте показано, что вирин-ЭНШ - слабый аллерген. ПДК в воде рыбохозяйственных водоемов 1 мг/л.

Принцип метода. В основе метода лежит специфическая реакция взаимодействия антигена (в данном случае полиэдров) с антителами, меченными флюоресцирующим красителем (ФИТЦ). Реакция выявляется в виде специфического свечения при наблюдении в люминесцентном микроскопе - ярко-зеленое свечение ободка полиэдров.

Метрологическая характеристика метода. Данным методом можно определить количество полиэдров в диапазоне от 0,5·10 до 10 полиэдров в 1 мл субстрата. Метод высокочувствительный и специфический. Способен дифференцировать различные виды полиэдров. Чувствительность метода в большой степени зависит от качества приготовленных гипериммунных сывороток.

Реактивы и материалы. Ацетон. Физиологический раствор (0,85%-ный NaCl), рН 7,1-7,5. Этиловый спирт. Нефлюоресцирующее иммерсионное масло. Сахароза. Мертиолят. Антибиотики (пенициллин, стрептомицин, нистатин).

Люминесцирующая ослиная сыворотка против глобулинов кролика (изготовляемая в Институте эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи), специфическая антиполиэдренная кроличья сыворотка.

Приборы, аппаратура, посуда. Люминесцентный микроскоп. Сетка для подсчета полиэдров. Объект-микрометр. Камера Горяева. Центрифуга (до 5000 об/мин). Термостат (37 °С). рН-Метр. Мембранные фильтры АФА-ВН-10. Электроаспиратор. Батометр. Пробирки. Чашки Петри. Предметные стекла. Пипетки мерные и пастеровские. Цилиндры стеклянные.

Подготовка к определению. При отсутствии централизованного изготовления специфических иммунных антиполиэдренных сывороток основная подготовительная работа сводится к приготовлению этих сывороток в лабораторных условиях.

Иммунную антиполиэдренную сыворотку получают путем внутривенной иммунизации кроликов суспензией очищенных полиэдров с титром 1х10 пдр/мл.

Полиэдры извлекают из препарата вирин-ЭНШ следующим образом. Проводят 3-кратный отмыв 100 мл препарата от глицерина физиологическим раствором при 5000 об/мин в течение 20 мин. Затем проводят дифференциальное центрифугирование при 300 об/мин для осаждения крупных частиц тканей насекомых в течение 3 мин. Супернатант осторожно отсасывают пипеткой и центрифугируют 20 мин при 5000 об/мин для осаждения полиэдров. Осадок ресуспендируют в физиологическом растворе и диспергируют на магнитной мешалке 10-15 мин. Дальнейшую очистку ведут в градиенте плотности 20, 30, 40, 50% сахарозы. Чистые полиэдры задерживаются на границе 40% и 50% сахарозы. Отбирают пипеткой этот слой и отмывают полиэдры от сахарозы путем 5-кратного разбавления физиологическим раствором с последующим центрифугированием при 5000 об/мин 30 мин. Отмывание проводят 3 раза. Полученный осадок ресуспендируют в 10 мл физиологическом растворе. Титр определяют в камере Горяева. Рабочее разведение для иммунизации 1·10 пдр/мл.

За сутки до введения животным взвесь полиэдров обрабатывают антибиотиками из расчета 500-1000 ед. пенициллина и стрептомицина, 20 ед. нистатина на 1 мл взвеси.