МУК 4.2.2429-08

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Метод определения стафилококковых энтеротоксинов в пищевых продуктах

     

Дата введения 2008-12-15

1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ Научно-исследовательский институт питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Шевелева, Н.Р.Ефимочкина); ГУ Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН (А.Л.Гинцбург, Ф.С.Флуер).

2. РЕКОМЕНДОВАНЫ К УТВЕРЖДЕНИЮ Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. УТВЕРЖДЕНЫ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 29 октября 2008 г.

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ с 15 декабря 2008 г.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

ВНЕСЕНЫ Дополнения и изменения N 1, утвержденные и введенные в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации c 26.06.2011

Дополнения и изменения N 1 внесены изготовителем базы данных по тексту М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2011 год

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают метод качественного определения стафилококковых энтеротоксинов в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, мясе и мясопродуктах; птице и птицепродуктах) на основе твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.

1.3. Методы предназначены для исследования пищевых продуктов при осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора и контроля, а также при санитарно-эпидемиологическом расследовании вспышек пищевых отравлений и инфекций с пищевым путем передачи.

1.4. Согласно настоящим методическим указаниям предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов соответствует диапазону массовых концентраций от 0,2 до 2,0 мкг/кг (в зависимости от типа токсина и вида продукта), что ниже уровня 100-200 нг наиболее распространенного из числа известных иммунологических типов стафилококкового энтеротоксина типа А, обусловливающего развитие стафилотоксикоза у человека.

1.5. Настоящие методические указания устанавливают также метод качественного обнаружения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, C1, С2, С3, D, Е (при совместном определении) в продовольственном сырье и пищевых продуктах животного происхождения (в молоке, молочных продуктах и сырах, в мясе и мясопродуктах; в птице и птицепродуктах) на основе фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа. Предел обнаружения стафилококковых энтеротоксинов при использовании данного метода составляет не менее 1,0 мкг/кг.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

2. Определения, обозначения и сокращения

СЭТ - стафилококковые энтеротоксины.

СЭА - стафилококковый энтеротоксин типа А.

СЭВ - стафилококковый энтеротоксин типа В.

ИФА - иммуноферментный анализ.

ИГ, IgG  - иммуноглобулины.

          
     Кг - конъюгат.

ОП - оптическая плотность.

Стандартный образец состава - стандартный образец, воспроизводящий значения величин, характеризующих содержание определенных компонентов (ГОСТ 8.315).

Калибровочный раствор - раствор компонента, приготовленный из стандартного образца состава и необходимый для проведения испытания.

3. Сущность метода

3.1. Методы основаны на детекции СЭТ, продуцируемых Staphylococcus aureus и другими коагулазоположительными стафилококками, в подготовленной соответствующим образом пробе пищевого продукта путем постановки иммунохимических тестов непрямого твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющего обнаруживать эпидзначимые типы стафилококковых энтеротоксинов А (СЭА) или В (СЭВ) при раздельном определении (тест-системы по ВФС 42-235* и 42-236*, ВС 89), а также энтеротоксины типов А, В, С, D и Е при совместном дифференцированном и недифференцированном определении

________________

* Документы является авторской разработкой. За информацией о документе Вы можете обратиться в Службу поддержки пользователей. - Примечание изготовителя базы данных.

(Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

3.2. Принцип метода. Определение СЭТ происходит за счет специфического взаимодействия стафилококковых иммуноглобулинов к различным типам СЭТ, адсорбированных на планшете, со стафилококковыми энтеротоксинами, содержащимися в исследуемом материале. Образовавшийся комплекс "антитело + антиген" выявляют с помощью конкурирующих стафилококковых иммуноглобулинов (конъюгатов), меченых пероксидазой. Образующийся аналитический сигнал, зависящий от результатов взаимодействия комплекса "антитело + антиген" с конъюгатом на поверхности ячеек планшета и выражающийся в ферментации субстрата - ортофенилендиамина (при раздельном определении СЭТ типов А и В) или тетраметилбензидина (при совместном определении СЭТ типов А, В, С, D и Е) с изменением его окраски, измеряется по регистрируемому значению оптической плотности при длинах волн 492 и 450 нм, соответственно. Схема анализа представлена в табл.1

Таблица 1

     
Схема анализа

3.3. Для проведения раздельного определения используются тест-системы иммуноферментные для определения стафилококковых энтеротоксинов типов А и В в виде лиофилизированных компонентов.

3.4. Для проведения совместного определения СЭТ используются тест-системы иммуноферментные для одновременного определения стафилококковых энтеротоксинов типов А, В, С, D, Е с использованием набора реагентов RIDASCREEN SET А, В, С, D, Е или других зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке тест-систем иммуноферментных с аналогичными характеристиками.

3.5. Метод фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа (ФС-ИФА) стафилококковых энтеротоксинов основан на связывании СЭТ, экстрагированных из пищевого продукта, с антителами, адсорбированными на внутренней поверхности пипетирующего устройства (твердая фаза), удалении (отмывке) несвязанных компонентов, добавлении антител, конъюгированных щелочной фосфатазой и флюоресцентно-меченого субстрата (4-метил-умбелиферилфосфата). Интенсивность флюоресценции измеряется при длине волны 450 нм дважды для каждого образца: перед внесением субстрата (фон) и после накопления продуктов гидролиза - флюоресцентного 4-метил-умбеллиферола, который катализируется щелочной фосфатазой.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

3.6. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы, позволяющие проводить измерение флюоресценции 4-метил-умбелиферола при 450 нм и тест-наборы, в состав которых входят наконечники, сенсибилизированные антителами к СЭТ типов А, В, С, D, Е, используемые в качестве пипетирующего устройства; и стрипы из 10 лунок, содержащие реагенты для проведения иммунофлюорес-центного анализа.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

3.7. Для определения СЭТ методом фермент-связанного флюоресцентного иммуноанализа используют автоматические иммуноферментные анализаторы и тест-наборы, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке.

(Введен дополнительно, Доп. и изм. N 1).

4. Требования к выполнению анализов

4.1. Условия безопасного проведения работ

При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019*, а также требования, изложенные в технической документации на приборы.

______________

* На территории Российской Федерации документ не действует. Действует ГОСТ Р 12.1.019-2009. - Примечание изготовителя базы данных.

Анализатор должен находиться в помещении, приспособленном для проведения микробиологических исследований. При работе с тест-наборами необходимо соблюдать следующие правила:

не использовать наконечники с поврежденной упаковкой;

не использовать поврежденные стрипы;

не использовать набор по истечении срока годности;

не смешивать реактивы из различных партий;

положительный контроль и стандарт содержат очищенный стафилококковый энтеротоксин. При работе соблюдать осторожность. Работать в защитной одежде, перчатках, очках. При попадании внутрь следует немедленно обратиться к врачу;

реактивы содержат натрия азид, который со свинцом и медью образует взрывчатые азиды металлов. Если жидкости, содержащие азид натрия, сливаются в водопроводную систему, необходимо промывать водосток во избежание их накопления;

пролитые жидкости необходимо тщательно вытирать после обработки детергентом и раствором бытового отбеливателя с содержанием натрия гипохлорита не менее 0,5%. Не автоклавировать растворы, содержащие отбеливатель;

анализаторы необходимо регулярно чистить и обеззараживать в соответствии с руководством по эксплуатации приборов.

4.2. Требования к квалификации специалистов

Выполнение измерений может проводить специалист, способный после освоения техники иммуноферментного анализа и приемов по эксплуатации аппаратуры получать результаты в пределах нормативов оперативного контроля погрешности.

4.3. Условия выполнения измерений

Измерения проводятся в нормальных лабораторных условиях:

температура окружающего воздуха (20±5) °С;

атмосферное давление (97±10) кПа;

относительная влажность (65±15)%.

Раздел 4. (Измененная редакция, Доп. и изм. N 1).

5. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

5.1. Средства измерений и вспомогательное оборудование