Методические указания
по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина)  и зеараленона в зерне и зернопродуктах

УТВЕРЖДАЮ

Начальник Главного санитарно-профилактического управления Минздрава СССР Чибураев В.И. 27 июня 1990 г. N 5177-90

Методические указания предназначены для лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и НИИ гигиенического профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов фузариотоксинами: дезоксиниваленолом (вомитоксином) и зеараленоном вместо действующих ранее "Методических указаний по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах" N 3940-85 и "Методических рекомендаций по обнаружению, идентификации и определению содержания зеараленона в пищевых продуктах" N 2964-84.

Разработаны в отделе гигиены питания Института питания АМН СССР: рук. отдела, профессор Тутельян В.А., рук. лаборатории гигиенических исследований имитируемых пищевых продуктов, кандидат химических наук Эллер К.И., старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Пименова В.В., младший научный сотрудник Музыченко Н.И., старший научный сотрудник лаборатории энзимологии питания, кандидат биологических наук Соболев B.C., старший лаборант Захарова Л.П.

Дезоксиниваленол и зеараленон являются микотоксинами, наиболее часто продуцируемыми широко распространенными микроскопическими грибами рода Fusarium (Fusarium graminearum, F.culmorum, F.roseum и др.), поражающими зерновые в ряде регионов страны.

Дезоксиниваленол (вомитоксин) - 3,7,15-тригидрокси-12,13-эпокси-трихотец-9-ен-8-он относится к группе трихотеценовых микотоксинов, вызывающих тяжелые алиментарные микотоксикозы у животных, которые характеризуются геморрагическим синдромом, отказом от корма, рвотой, поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов.

В СССР установлена временная ПДК на содержание дезоксиниваленола в продовольственном заготавливаемом зерне на уровне 1,0 мг/кг - в сильных и твердых сортах пшеницы и на уровне 0,5 мг/кг - в остальной пшенице ("Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов", Минздрав СССР, 1989), в переработанном зерне - на уровне не выше 0,5 мг/кг.

Дезоксиниваленол - бесцветное кристаллическое вещество с молекулярной массой 296 а.е.м., имеет слабо выраженный максимум поглощения УФ-света при длине волны 219 нм (е 4500 в метаноле), не обладает флуоресценцией. Температура плавления 151-153°С. Дезоксиниваленол хорошо растворим в воде, спиртах, ацетонитриле, этилацетате, нерастворим в гексане и бензоле. Обнаружение дезоксиниваленола при тонкослойной хроматографии (ТСХ) производят по специфической флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия.

Зеараленон - лактон 6-(10-окси-6-кето-транс-1-ундеценил)-b-резорциловой кислоты (F-2-токсин), обладает выраженным эстрогенным действием на большинство видов сельскохозяйственных животных, а также на приматов, вызывая нарушения функций воспроизводства.

В СССР установлена ПДК на содержание зеараленона в зерновых на уровне 1 мг/кг.

Зеараленон - бесцветное кристаллическое вещество, плохо растворим в воде и гексане, хорошо растворим в низших спиртах, ацетонитриле, ацетоне, бензоле, с молекулярной массой 318 а.е.м. и максимумами поглощения в УФ-спектре (в этаноле) при 236 нм (е 29700), 274 нм (е 13909) и 316 нм (е 6020). Зеараленон обладает сине-голубой флуоресценцией низкой интенсивности при возбуждении длинноволновым (360 нм) УФ-светом, которая повышается при возбуждении коротковолновым УФ-светом (254 нм). Интенсивность флуоресценции усиливается после обработки зеараленона раствором хлористого алюминия в этиловом спирте. Более высокая чувствительность обнаружения зеараленона при ТСХ достигается при использовании реакции азосочетания с растворами стабильных диазониевых солей: прочной синей В-соли или прочной фиолетовой В-соли, в результате которой образуется интенсивно окрашенные продукты.

Предлагаемый метод определения дезоксиниваленола и зеараленона в одном образце зерна и зернопродуктов включает следующие этапы:

- экстракцию дезоксиниваленола и зеараленона из образца смесью ацетонитрил-вода (84:16);

- очистку одной части экстракта на колонке со смесью угля с оксидом алюминия;

- определение дезоксиниваленола в очищенном экстракте с помощью ТСХ с флуориметрическим обнаружением после обработки пластинок хлоридом алюминия или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на силикагеле с УФ-детектором при длине волны 224 нм;

- обезжиривание второй части экстракта гексаном;

- разбавление экстракта водой и переэкстракция зеараленона в бензол;

- определение зеараленона с помощью одномерной или двумерной ТСХ с флуориметрическим обнаружением после обработки пластинок хлоридом алюминия или с помощью нормальнофазовой ВЭЖХ с УФ детектором при длине волны 283 нм или флуориметрическим детектором (длина волны возбуждающего света 283 нм, эмиссионного света - от 420 нм).

Продолжительность анализа 3,5-4 часа.

Предел обнаружения метода:

для дезоксиниваленола 0,2 мг/кг (по ТСХ); 0,05 мг/кг (по ВЭЖХ);

для зеараленона 0,1 мг/кг (по ТСХ); 0,005 мг/кг (по ВЭЖХ).

Относительное стандартное отклонение:

для дезоксиниваленола 0,25-0,30 (по ТСХ); 0,05-0,09 (по ВЭЖХ);

для зеараленона 0,40-0,60 (по ТСХ); 0,06-0,09 (по ВЭЖХ).

Степень извлечения добавленных в пробу фузариотоксинов составляет 80-85% для дезоксиниваленола и 85-90% для зеараленона.

Оборудование и материалы

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ - 6С по ТУ 64-1-2451-78 или аналогичный.

2. Ротационный испаритель ИР-1М по ТУ 25-11-917-76 (завод "Химлабприбор") с ловушкой или аналогичный испаритель.

3. Мельница лабораторная электрическая ЭМ-ЗА по ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа 0ЛД-41 или "Люминоскоп" ЛПК-1.

5. Жидкостной хроматограф с УФ-детектором с переменной длиной волны (для анализа зеараленона возможно также использование флуориметрического детектора) колонка и предколонка с силикагелем с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр - 4,6 мм.

6. Микрошприцы МШ-10 на 10 мкл, микрошприцы на 10 или 25 мкл для ВЭЖХ.

7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками.

8. Пластинки для ТСХ "Силуфол" размером 15x15 см или 20x20 см, производство ЧСФР.

9. Колбы плоскодонные конические, 250 мл, НШ 29, тип КнКШ 250-29/32, ГОСТ 10394-74*.

_______________

* Вероятно, ошибка оригинала. Следует читать: ГОСТ 10394-72, здесь и далее по тексту. - Примечание изготовителя базы данных.

10. Колбы грушевидные на 100 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

11. Колбы грушевидные на 10-20 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

12. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

13. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

14. Воронки делительные ВД2-250 по ГОСТ 8613-75.

15. Колонка стеклянная хроматографическая 220x15 мм.

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Стандартные растворы дезоксиниваленола в этилацетате с концентрацией 25 нг/мкл каждый, стандартный раствор зеараленона в бензоле с концентрацией 10 нг/мкл.

18. Ацетонитрил "ч." по ТУ 6-09-3534-74.

19. Ацетон "ч.д.а." по ГОСТ 2603-79.

20. Бензол "ч.д.а." по ГОСТ 5955-75.

21. Гексан "ч." по ТУ 6-09-3375-78 или гептан "ч.д.а." по ГОСТ 5.395-70.