МУ 1.1.578-96

Методические указания

1.1. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ. ГИГИЕНА, ТОКСИКОЛОГИЯ, САНИТАРИЯ

Требования к постановке экспериментальных исследований по обоснованию предельно допустимых концентраций промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы

Дата введения: с момента утверждения

УТВЕРЖДАЮ Первый заместитель Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С.В.Семенов 21 октября 1996 г.

1. РАЗРАБОТАНЫ НИИ медицины труда РАМН (Дуева Л.А., Алексеева О.Г.), НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды РАМН (Пинигин М.А., Тепикина Л.А.), Институтом иммунологии Минздравмедпрома России (Черноусов А.Д.), Центральным кожно-венерологическим институтом Минздравмедпрома России (Умеров Ж.Г.), Санкт-Петербургским НИИ гигиены труда и профзаболеваний Минздравмедпрома России (Сидорин Г.И., Мартинсон Т.Г.), Белорусским научно-исследовательским санитарно-гигиеническим институтом (Шевляков В.В.), Харьковским НИИ гигиены труда и профзаболеваний (Василенко Н.М.), Центральной научно-исследовательской лабораторией Латвийской медицинской Академии (Иванова И.А.).

2. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Первым заместителем Председателя Госкомсанэпиднадзора России - заместителем Главного государственного санитарного врача Российской Федерации С.В.Семеновым 21 октября 1996 г.

3. ВВЕДЕНЫ взамен методических рекомендаций "Постановка исследований по гигиеническому нормированию промышленных аллергенов в воздухе рабочей зоны" (1980) и в дополнение к "Временным методическим указаниям по обоснованию предельно допустимых концентраций загрязняющих веществ в атмосферном воздухе населенных мест" (1989).

1. Область применения

Методические указания предназначены для токсикологов, занимающихся обоснованием гигиенических нормативов вредных веществ в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Методические указания посвящены установлению гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы. Более чем десятилетняя практика обоснования гигиенических нормативов (ПДК и ОБУВ) промышленных аллергенов в воздушной среде подтвердила эффективность данного мероприятия по профилактике развития аллергических заболеваний у рабочих аллергоопасных производств и населения промышленных регионов. Настоящие методические указания разработаны с учетом накопленных за эти годы данных по теории и практике токсикологической аллергологии. При этом предусмотрен единый подход к обоснованию гигиенических нормативов промышленных химических аллергенов в воздухе рабочей зоны и атмосферы.

Оценка аллергоопасности при установлении гигиенических нормативов химических соединений и сложных продуктов на их основе обязательно проводится в следующих случаях:

- при нормировании новых химических соединений, принадлежащих к химическим классам, не изученным в аллергологическом плане;

- при нормировании химических соединений и сложных продуктов, принадлежащих к химическим классам, содержащим уже известные аллергены, или имеющих химические аналоги, обладающие сенсибилизирующим действием;

- при наличии жалоб аллергического характера или клинических признаков аллергических поражений у людей, имеющих контакт с данным химическим соединением или продуктом.

2. Схема постановки исследований

Исследования проводят в два этапа. Цель 1-го этапа - выявление аллергенных свойств изучаемого вещества, 2-го этапа - обоснование величины гигиенического норматива (см. схему).

Схема постановки исследований

I этап - выявление аллергенных свойств

II этап - обоснование величины санитарного стандарта

А. Нормирование по аналогии

Б. Нормирование по ускоренной и полной схеме

На 1-м этапе исследований используют методы экспресс-сенсибилизации морских свинок и мышей.

При изучении простых химических соединений рекомендуется применение метода сенсибилизации морских свинок внутрикожно в зону уха и/или воспроизведение гиперчувствительности замедленного типа (далее - ГЗТ) на мышах.

Сенсибилизация морских свинок, как наиболее чувствительного вида лабораторных животных к действию химических аллергенов, позволяет оценить аллергенную активность изучаемого вещества. С этой целью животных сенсибилизируют введением в зону уха двух доз вещества: 50 и 200 мкг/животное. Воспроизведение ГЗТ на мышах позволяет выявить аллергенные свойства не только растворимых, но также не растворимых в воде твердых и пастообразных веществ, обладающих сильной или умеренной аллергенной активностью. Поскольку введение мышам слабых аллергенов не проявляется развитием четко выраженной ГЗТ, при отрицательном или сомнительном результате данного эксперимента на мышах следует дополнительно провести сенсибилизацию морских свинок в дозе 200 мкг/животное. При этом, а также для веществ с предполагаемой слабой аллергенной активностью, не исключается использование еще более высокой сенсибилизирующей дозы - 500 мкг/животное. При изучении сложных по составу и неотвержденных полимерных продуктов осуществляют комбинированную сенсибилизацию морских свинок (в кожу уха и дополнительно эпикутанно) и/или применяют метод воспроизведения ГЗТ на мышах.

В дополнение к этим обязательным приемам исследований I-го этапа по соответствующим показаниям могут быть использованы также и другие способы сенсибилизации животных. Так, при исследовании химических соединений и продуктов, особенно пастообразных и вязких, загрязняющих кожные покровы рабочих, целесообразна проверка возможности развития контактной аллергии методом многократных эпикутанных аппликаций на морских свинках. Для водонерастворимых промышленных пылей уже на I-м этапе исследования может быть применен способ внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс.

Если на I-м этапе исследования аллергенные свойства у изучаемого вещества не выявлены, то его нормируют как вещество общетоксического действия. Если хотя бы один из приемов сенсибилизации позволил выявить аллергенные свойства изучаемого вещества, то обязательно проводят II-й этап исследований.

II-й этап исследований, в зависимости от приема нормирования (по аналогии, ускоренной или полной схеме), включает следующие токсиколого-аллергологические эксперименты.

При нормировании по аналогии проводят сравнение выраженности и частоты сенсибилизации у животных, вызванных введением референс-аллергена и изучаемого вещества, используя методы экспресс-сенсибилизации I-го этапа. При нормировании нерастворимых пылей возможно также применение внутритрахеальной сенсибилизации белых крыс. Для простых химических соединений референс-аллергеном является уже нормированное вещество, сходное по своей химической структуре и содержащее одинаковые ответственные за развитие сенсибилизации активные химические группы. Референс-аллергеном для сложной композиции служит уже нормированная композиция, близкая по составу и содержащая одинаковый ответственный за развитие сенсибилизации ингредиент.

При отсутствии референс-аллергена II-й этап исследований включает экспериментальное определение порогов сенсибилизации: при однократной ингаляции вещества - Lim, при многократных ингаляциях - Lim. Сравнение величин Lim и Lim с Lim и Lim, установленных в токсикологических экспериментах по интегральным и специфическим эффектам, позволяет определить, является ли сенсибилизирующее действие лимитирующим. С учетом этих данных обосновывают величину гигиенического норматива (см. раздел 6).

При нормировании сложных химических продуктов сенсибилизацию животных на обоих этапах исследования осуществляют цельным продуктом; при выявлении сенсибилизации для тестирования применяют все основные ингредиенты в чистом виде, а при неизвестном составе - цельный продукт или вытяжку из него (см. раздел 53).

3. Постановка исследований по выявлению аллергенных свойств

3.1. Внутрикожная сенсибилизация морских свинок

В эксперименте используют молодых морских свинок массой 250-300 г, разделенных на 2 опытных и одну общую контрольную группы по 8-10 животных в каждой. Животных опытных групп сенсибилизируют, вводя однократно в кожу наружной поверхности уха ближе к его основанию 50 (I-я опытная группа) и 200 мкг на животное (2-я опытная группа) изучаемое вещество в объеме 0,02-0,1 мл. В качестве растворителей применяют дистиллированную воду, физиологический раствор, ацетон, спирт, твин-80, диметилсульфоксид и др. При изучении маслообразных продуктов используют водные эмульсии, а для отвержденных полимеров - вытяжки (см. раздел 5.3). Контрольным животным вводят в том же объеме растворитель, эмульгатор или экстрагирующую жидкость.

Выявление сенсибилизации (см. раздел 5) проводят через 8-10 дней. Сильные аллергены в обеих дозах вызывают у морских свинок выраженную сенсибилизацию: среднегрупповой показатель аллергологических тестов статистически достоверно отличается от такового у контрольных животных. Умеренные аллергены выраженную сенсибилизацию вызывают лишь при введении в дозе 200 мкг на животное, а при введении 50 мкг на животное - слабую, при которой сенсибилизация обнаруживается у 1/3-1/2 части животных, а среднегрупповые показатели аллергологических тестов могут не отличаться от таковых у контрольных животных. Слабые аллергены вызывают слабую сенсибилизацию лишь при введении вещества в дозе 200 мкг на животное, при этом положительными могут быть лишь тесты с клетками крови, а кожные пробы - отрицательными.

3.2. Комбинированная сенсибилизация морских свинок

Сложные продукты и неотвержденные полимеры могут очень плохо всасываться, и в этом случае сенсибилизация у морских свинок не наступает даже при введении в кожу уха 200 мкг/жив. Для окончательного решения о наличии аллергенных свойств при отрицательных результатах аллергологического тестирования животных на следующий день начинают эпикутанные аппликации вещества. После 7-й аппликации повторно проводят тестирование морских свинок.

Концентрацию вещества для эпикутанных аппликаций подбирают в процессе изучения раздражающего кожу действия или в специальном эксперименте: 6-8 морским свинкам массой 250-300 г в течение 7-10 дней (по 5 раз в неделю) наносят по 3 капли изучаемого вещества и его разведений 1:2, 1:10 и 1:100 на выстриженные "окошки" боковой поверхности туловища размером 2x2 см. В качестве растворителя удобно использовать летучий, не раздражающий кожу растворитель (ацетон, 70°-ный спирт, диметилсульфоксид). Если образуется пленка, то ее через 4 часа смывают, в остальных случаях кожу ничем не обрабатывают. Из нерастворимых веществ готовят мази (лучше на ланолине, а не на вазелине), которые распределяют глазной лопаточкой по поверхности "окошка". Для сенсибилизации выбирают максимальную концентрацию, не вызвавшую развития контактного дерматита.

3.3. Определение ГЗТ на мышах

В опытную и контрольную группы берут по 10 мышей чистой линии (BALB/C, СА-1, ДВА/2) или по 16-20 белых беспородных мышей массой 18-20 г. Животных сенсибилизируют 10 мМ или 100 мкг изучаемого вещества однократно внутрикожно в основание хвоста. Сенсибилизирующая доза вещества эмульгируется в 60 мкл смеси полного адьюванта Фрейнда (ПАФ) и раствора Хенкса рН 7,5, приготовленной в соотношении 1:1. Состав ПАФ: 1 мл ланолина, 3 мл вазелинового масла, 5 мг убитой нагреванием вакцины БЦЖ. В этот объем ПАФ добавляют 50 мкл твина-20 и 0,5 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют. Контрольным животным вводят 60 мкл данной смеси без добавления изучаемого вещества.

Для выявления сенсибилизации через 5 суток в подушечку задней лапы мышей вводят такое же, как и при сенсибилизации, количество изучаемого вещества (10 мМ или 100 мкг), растворенного (взвешенного) в растворе Хенкса. Через 24 часа измеряют инженерным микрометром МК-0-25 толщину обеих задних лап в мм. О величине отека, т.е. о развитии ГЗТ, судят по разнице в толщине обеих задних лап (показатель ГЗТ). У контрольных животных она, как правило, составляет 0,04-0,09 мм. Статистически достоверное превышение среднегруппового показателя ГЗТ опытных животных по сравнению с контрольными свидетельствует о наличии выраженных или умеренных сенсибилизирующих свойств у изучаемого соединения.

3.4. Многократные эпикутанные аппликации на морских свинках

Подбор сенсибилизирующей концентрации осуществляют так же, как при комбинированной сенсибилизации (см. раздел 3.2). Эпикутанные аппликации проводят по 5 раз в неделю в течение 4 недель (всего 20 аппликаций). Если на 2-3-й неделе опыта у морских свинок появляются признаки контактного дерматита, то сенсибилизирующие аппликации продолжают на другом участке кожи. Выявление сенсибилизации проводят через 1-2 суток после последней аппликации. При этом капельную кожную пробу ставят на противоположном боку.

4. Постановка исследований по обоснованию величины гигиенических нормативов

4.1. Интратрахеальная сенсибилизация белых крыс

Двум группам белых крыс вводят однократно в трахею 0,5-1,0 мл суспензии максимально измельченной изучаемой пыли в дозах по 50 и 10 мг на подогретом до 37 °С физиологическом растворе. Животным контрольной группы вводят по 1 мл подогретого до 37 °С физиологического раствора.

Процедуру введения лучше осуществлять без наркоза. Для этого крысу фиксируют в вертикальном положении, вводят в ротовую полость металлический зонд, закрепленный на шприце с соответствующей дозой суспензии, проводят его по передней стенке гортани через голосовую щель (возникает ощущение препятствия) до упора в бифуркацию трахеи, слегка приподнимают зонд и осуществляют введение. После введения животное продолжают держать в вертикальном положении на протяжении нескольких дыхательных движений. При этом хрипы и хлюпающий звук подтверждают проникновение суспензии в легкие.

Тестирование животных всех групп проводят через 5 суток после интратрахеального введения.

4.2 Однократное ингаляционное воздействие