МУ 4.2.2008-05
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ
Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО)
растительного происхождения с применением ферментного анализа
на биологическом микрочипе
Дата введения: с момента утверждения
1. РАЗРАБОТАНЫ ГУ НИИ питания РАМН (В.А.Тутельян - руководитель, Е.Ю.Сорокина, О.Н.Чернышева, Н.А.Кашина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзора (Т.В.Воронцова, Т.Н.Потапова); Инновационной корпорацией "Биозащита" (И.В.Панкин).
2. РЕКОМЕНДОВАНЫ к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.
3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Г.Г.Онищенко 17 октября 2005 года.
4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ
1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001".
1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 30.03.99 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Законом Российской Федерации от 07.02.92 N 2300-I (в редакции от 21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей", постановлением Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", постановлением Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации", постановлением Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании".
1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации.
1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в т.ч., в продовольственном сырье.
Методические указания содержат описание метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизации продуктов амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptll). Идентификация этих последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения. Чувствительность метода не менее 10 г (1пг) ДНК.
3.1. Аппаратура и инструменты
Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки, вместимостью 0,2; 0,5 см, со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5° С/с | ТУ 9642-001-4648062-98 | |
Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" | ТУ 9443-001-02699501-03 | |
Компьютерная программа "Arra" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001" | ||
Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами (прилож.1А) | ТУ 4320-002-71321417-04 | |
Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С точность поддержания температуры ±1 °С | ТУ 42-61961 | |
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более ±0,0001 г | ||
Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа "Эппендорф" вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5 | ||
Камера морозильная, обеспечивающая температуру минус 20 °С | ||
Холодильник бытовой | ||
Микроцентрифуга настольная типа "Эппендорф" с частотой вращения не менее 13000 мин | ||
Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость вращения 250-3000 мин | ||
Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды | ||
Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5-10,0 мм (шаг - 0,1 мм, точность ±2,5-10,0%, воспроизводимость 3-7%); 0,5-50,0 мм (шаг - 0,5 мм, точность ±2,0-5,0%, воспроизводимость 2,5-5%); 20,0-200,0 мм (шаг - 1,0 мм, точность ±1,5-2,0%, воспроизводимость 2-3%); 100-1000 мм (шаг - 5 мм, точность ±1,0-1,5%, воспроизводимость 1-2%); 2000-10000 мм (шаг - 10 мм, воспроизводимость 1-2%) | ||
Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 или других видов | ТУ 16-535-84 |
Примечание. Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке.
3.2. Лабораторная посуда и материалы
Бумага фильтровальная лабораторная | ||
Воронки стеклянные | ||
Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические, вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 см | ||
Чашки Петри | ||
Цилиндры стеклянные мерные лабораторные, вместимостью 25, 100, 1000 см | ||
Пробирки микроцентрифужные типа "Эппендорф", вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 см | ||
Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 мм |
3.3. Реактивы и реагенты
Додецилсульфат натрия (SDS) | ||
Натрия гидроокись | ||
Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), хч | ТУ 6-09-11-1721-83 | |
Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287 | ||
Спирт этиловый ректификованный | ||
Вода дистиллированная | ||
Вода деионизованная | ОСТ 11.029.003-80 | |
3%-й раствор пероксида водорода |
Примечание. Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9 000 или EN 29 000.
Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на 100 реакций | ||
Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г, лизирующий реагент - 60 см (2 флакона), сорбент - 2 см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 см, экстракционный раствор - 10 см) | ТУ 2643-003-71321417-04 |
Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в п.4.1. Остальные реагенты готовы к использованию.
Набор реагентов для амПЦР (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед, 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 см , праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты: | ТУ 2643-003-71321417-04 | |||
35S_п 5' CGG CTA CTC CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT TTC AGA AGA | (39 н.о.); | |||
35S_o* 5' ССА ТТТ ТСС ТTT ТTT АТТ GTC СТТ TCG ATG AAG TGA CAG А | (40 н.о.); | |||
праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli: | ||||
gus_ 5' ACC GTA CCT CGC АТТ АСС СТТ ACG СТG AAG AGA | (33 н.о.); | |||
gus_o* 5' TGC CCG CTT CGA AAC CAA TGC CTA AAG AGA | (30 н.о.); | |||
праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: | ||||
nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA | (32 н.о.); | |||
nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT ССА GA | (35 н.о.); | |||
праймеры на маркерный ген nptll из транспазона Tn5 бактериального происхождения: | ||||
npt_п 5' GTG ACC CAT GGC GAT GCC TGC TTG С | (25 н.о.); | |||
npt_o* 5' ACC CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA ТСС AGA | (30 н.о.); | |||
праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: | ||||
ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC CTA AAA GA | (32 н.о.); | |||
ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA | (32 н.о.). |
Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 см.
Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptll_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o*; nptll_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки.
Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа: 20хSSC - 50 см; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 см с концентрацией 1 мг/см, 1 пробирка | ТУ 2643-003-71321417-04 |
Примечание. Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от 2 до 8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы.
4.1. Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0)