МУК 3.3.2.1063-01

     

3.3.2. МЕДИЦИНСКИЕ ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Определение антикомплементарной активности
препаратов иммуноглобулинов для
внутривенного введения

Measurement of anticomplementary activity
of immunoglobulins for intravenous use

Методические указания

     

Дата введения 2001-10-01

1. В разработке методических указаний принимали участие сотрудники Нижегородского государственного предприятия по производству бактерийных препаратов - фирмы "ИмБио": к.м.н. Т.А.Крайнова, д.б.н. В.В.Анастасиев, Т.В.Короткова, Т.Б.Змачинская, Л.М.Ефремова; Государственного научно-исследовательского института стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А.Тарасевича: к.м.н. Л.В.Минакова, к.м.н. Л.К.Лаптева.

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 12 июля 2001 г.

1. Область применения

Настоящие методические указания предназначены для работников предприятий, осуществляющих контроль качества препаратов иммуноглобулинов для внутривенного введения.

Все положения настоящего документа распространяются на предприятия, производящие МИБП, независимо от их принадлежности и формы собственности.

2. Общие положения

Согласно требованиям ВОЗ, все серии иммуноглобулинов для внутривенного введения подлежат обязательному испытанию на антикомплементарную активность (АКА). (Материалы ВОЗ, 1992.) При внутривенном введении иммуноглобулинов с высокой антикомплементарной активностью у реципиента могут возникнуть тяжелые анафилактоидные реакции. Уровень АКА и клиническая безопасность являются предметом обсуждения более 10 лет (S. Munkarious, J. Hooper, 1988). Большинство исследователей полагает, что уровень АКА in vitro будет иметь значение для прогноза возможного побочного действия препаратов in vivo. У различных препаратов, производимых в мире, существенно различаются показатели АКА (J. Romer et all, 1982). Наличие значительных отличий в АКА дало основание отдельным авторам считать связь между АКА и безопасностью препарата при внутривенном введении сомнительной. Большинство же исследователей полагает, что данный тест является способом определения повреждения структуры иммуноглобулина и должен быть обязательно контролируемым параметром стабильности производства. Абсолютным критерием допуска к применению препаратов служит их переносимость при внутривенном введении.

Метод определения АКА основан на способности иммуноглобулинов связывать комплемент, препятствуя лизису сенсибилизированных эритроцитов.

Существует множество модификаций метода определения АКА. Методы определения и единицы измерения АКА, используемые различными авторами, трудно сравнимы.

Настоящие методические указания составлены с учетом требований Европейской фармакопеи 1997 г. Нами разработана модификация этого метода. Предлагаемый метод определения антикомплементарной активности иммуноглобулинов обладает достаточно высокой чувствительностью, хорошей воспроизводимостью и простотой выполнения. Важным преимуществом метода является выражение результатов определения в единицах комплемента, связавшегося с 1 мг белка иммуноглобулина. Это позволяет количественно оценивать как низкую, так и высокую антикомплементарную активность. Положительной чертой метода является также расширенный контроль реагентов, используемых для постановки реакции как комплемента, так и гемолитической сыворотки, что улучшает воспроизводимость результатов реакции. Настоящие рекомендации предназначены для определения антикомплементарной активности в препаратах иммуноглобулина для внутривенного введения на этапах его изготовления и хранения и вводятся взамен методических рекомендаций "Определение антикомплементарной активности препаратов иммуноглобулинов" (Нижний Новгород, 1988).

3. Описание метода определения антикомплементарной активности

Для измерения антикомплементарной активности иммуноглобулина фиксированное количество тестируемого материала (0,2 мл 5%-ного раствора препарата, т.е. 10 мг иммуноглобулина) инкубируют с определенным количеством комплемента морской свинки (20 гемолитических единиц СН50), и затем определяют количество несвязавшегося комплемента; антикомплементарную активность выражают как расход СН50 на 1 мг иммуноглобулина. Допустимый предел связывания комплемента - не более 1 гемолитической единицы СН50 на 1 мг иммуноглобулина для внутривенного введения.

3.1. Приготовление реактивов

3.1.1. Приготовление цитратного раствора

20,5 г глюкозы, 8,0 г натрия лимонно-кислого трехзамещенного и 4,2 г натрия хлорида растворяют в 750 мл дистиллированной воды. рН раствора доводят до 6,1 10%-ным раствором лимонной кислоты, объем - до 1000 мл дистиллированной водой. Стерилизуют текучим паром в течение 30 мин при температуре 100 °С. Хранят при температуре 4 °С в течение месяца.

3.1.2. Приготовление базового раствора кальция и магния

2,2 г хлорида кальция двухводного и 10,17 г хлорида магния шестиводного растворяют в дистиллированной воде и доводят объем раствора до 100 мл. Хранят при температуре 4 °С не более 1 месяца.

3.1.3. Приготовление базового раствора барбиталового буфера

В мерную колбу емкостью 2000 мл вносят 85 г хлорида натрия и 3,75 г барбитала натрия (мединала), добавляют 5,75 г барбитала (веронала), предварительно растворенного при нагревании в 200-300 мл дистиллированной воды, и устанавливают рН 7,3, используя 1 н соляную кислоту. Объем раствора доводят до 2000 мл дистиллированной водой. Стерилизуют текучим паром при 100 °С в течение 30 мин. Хранят при температуре 4 °С не более 1 месяца.

3.1.4. Приготовление рабочего
желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР)

1 г желатина растворяют в 400 мл дистиллированной воды при нагревании на водяной бане при температуре 70-100 °С. Полученный раствор охлаждают и вносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 1 мл базового раствора кальция и магния и 200 мл базового раствора барбиталового буфера. Объем раствора доводят до 1000 мл дистиллированной водой. Используют свежеприготовленным.

3.1.5. Приготовление эритроцитов барана

Берут один объем крови барана и один объем цитратного раствора, перемешивают. Хранят при температуре 4 °С. Кровь можно использовать в течение 28 дней, но не ранее чем через 7 дней после взятия.

3.2. Постановка реакции определения антикомплементарной
активности иммуноглобулинов

3.2.1. Приготовление 5%-ной суспензии эритроцитов барана

Объем крови, необходимый для работы, отбирают стерильно и промывают физиологическим раствором. Промывку осуществляют с помощью центрифугирования суспензии в течение 10 мин при 200 (1,5-2 тыс. об./мин). Осадок эритроцитов промывают не менее 3 раз 10-кратным (к объему эритроцитов) количеством желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР) до получения бесцветной промывной жидкости. 5%-ную суспензию эритроцитов готовят в том же самом буферном растворе. Плотность клеточной суспензии определяют следующим образом. К 0,2 мл суспензии эритроцитов добавляют 2,8 мл воды и центрифугируют гемолизированный раствор при 400 (3-4 тысячи об./мин). Измеряют оптическую плотность раствора в кювете с толщиной слоя 10 мм, против воды. Плотность клеточной суспензии считают приемлемой, если оптическая плотность надосадочной жидкости при длине волны 541 нм составляет 0,62±0,01. Корректируют плотность суспензии до этого показателя добавлением желатин-барбиталового буферного раствора в соответствии с формулой:

,

где - конечный объем суспензии;

- начальный объем суспензии;

- оптическая плотность исходной суспензии при длине волны 541 нм.

Если оптическая плотность ниже 0,61, то добавляют необходимое количество отмытых эритроцитов.

В случае проведения анализа с использованием фотоэлектроколориметра берут 0,5 мл суспензии эритроцитов и 7,0 мл воды. Измерение проводят в кювете с толщиной оптического слоя 10 мм, при длине волны 540 нм. Плотность клеточной суспензии считают приемлемой в случае, если величина поглощения находится в пределах 0,59±0,1. При других показаниях корректируют плотность суспензии, как описано выше.

3.2.2. Титрование гемолитической сыворотки