МУК 4.1.1912-04

     

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     

4.1. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

     
Определение остаточных количеств левомицетина
(Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
и иммуноферментного анализа

     

Дата введения 2004-05-01

1. РАЗРАБОТАНЫ: ГУ НИИ питания РАМН (В.А.Тутельян, С.А.Хотимченко, С.А.Шевелева, В.К.Кирничная, Т.В.Киселева, Н.Г.Орлова, Н.Р.Ефимочкина, Н.В.Барбер), Московским государственным университетом им. М.В.Ломоносова (А.М.Егоров, А.Ю.Колосова, Ж.В.Самсонова).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Минздрава России.

3. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 6 марта 2004 года.

4. ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ 1 мая 2004 года.

5. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов в соответствии с СанПиН 2.3.2.1078-01 "Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов".

Методические указания распространяются на методы с различным целевым назначением (арбитраж, скрининг). Два метода определения остаточных количеств левомицетина (хлорамфеникола, хлормицетина) в продуктах животного происхождения:

I - высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

II - иммуноферментного анализа (ИФА).

2. Общие положения

Среди ряда веществ, которые могут контаминировать продовольственное сырье и пищевые продукты, важное место занимают ветеринарные препараты, используемые как для лечения животных, так и в качестве стимуляторов роста. Сильнодействующими лекарственными препаратами, используемыми в ветеринарии, остаются антибиотики. Известно большое число антибиотиков, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животных, характером метаболизма и т.д.

Систематическое поступление в организм человека антибиотиков с продуктами питания крайне вредно, поскольку они могут оказывать нежелательные эффекты, чаще всего в виде возникновения аллергических реакций, дисбактериозов, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору кишечника, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов в переработке мяса, рыбы, молока (в частности, при получении кисломолочных продуктов) и других продуктов. Кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.

Хлорамфеникол (далее - ХАФ) является антибиотиком широкого спектра действия, обладающим высокой активностью в отношении бактерий и риккетсий. В отличие от многих антибиотиков ХАФ обладает довольно простым химическим строением.

Формула хлорамфеникола     

Хлорамфеникол малорастворим в воде, но хорошо в спирте. Установлено, что ХАФ медленно выводится из организма животных и сравнительно долго сохраняет свою активность при хранении продуктов.

В настоящее время для определения ХАФ в продуктах питания применяют ряд методов, в их числе микробиологические методы, которые являются сравнительно простыми и дешевыми, однако отличаются недостаточной специфичностью и воспроизводимостью результатов.

Для арбитражных исследований вводятся хроматографические методы, в частности ВЭЖХ, позволяющий раздельно определять как ХАФ, так и его метаболиты.

Количественный метод определения ХАФ при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии в сельскохозяйственных продуктах, отличается низким пределом обнаружения (0,01 мг/кг), хорошей воспроизводимостью (относительное стандартное отклонение 0,15-0,21) и надежностью.

Для скрининговых целей в мире широко применяют методы иммунохимического анализа, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность и точность. Для контроля пищевой продукции предпочтение отдается методам твердофазного иммуноферментного анализа, которые являются высокочувствительными (предел обнаружения - 0,00008 мг/кг).

Методические указания предназначены для учреждений госсанэпидслужбы Минздрава РФ и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. Согласно СанПиН 2.3.2.1078-01 содержание левомицетина в продуктах животного происхождения не допускается.

3. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб аналогичен для обоих методов исследования.

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТов на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 "Мясо", ГОСТ 7202.0-74 "Мясо птицы", ГОСТ 3622-68 "Молоко и молочные продукты".

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками или укладывают в коробки. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб или, в случае необходимости, хранят на холоде, а для скоропортящихся продуктов осуществляют замораживание -4-10 °С, используя для этой цели холодильники или соответствующие приспособления.

К исследованию скоропортящихся образцов следует приступать в день их доставки в лабораторию. При отсутствии такой возможности образцы должны хранить при указанной выше температуре не более двух недель со времени отбора среднего образца.

4. Определение остаточных количеств левомицетина
(Хлорамфеникола, Хлормицетина) в продуктах животного происхождения
методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.1. Принцип метода

Метод основан на извлечении хлорамфеникола экстракцией этилацетатом, последовательной промывке экстракта разбавленным раствором щелочи и кислоты, обезжиривании петролейным эфиром и хроматографическом разделении с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в обращенно-фазном варианте.

4.2. Аппаратура, материалы, реактивы

4.3. Требования техники безопасности при проведении испытаний

Помещение, в котором проводится определение хлорамфеникола, должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Все операции анализа необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты.

4.4. Подготовка к испытанию

4.4.1. Приготовление растворов

Взвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 см и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина 1 мг/мл. В мерную колбу на 25 см помещают 0,25 см полученного раствора и разбавляют метанолом до метки. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.

4.5. Проведение испытания методом ВЭЖХ

4.5.1. Подготовка образца для определения левомицетина в молоке

Смешивают 25 см молока с 12 г безводного сульфата натрия и экстрагируют (3 раза по 15 см этилацетата). Полученную смесь центрифугируют 15 мин со скоростью 4000 об./мин и декантируют. Этилацетатный слой промывают последовательно 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением в него 0,2 см 10% NaOH; 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 см 10% СНСООН; 5 см насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см петролейным эфиром. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см метанола.

4.5.2. Подготовка образца для определения левомицетина в мясе

Гомогенизируют 10 г мяса с 15 см фосфатного буфера (0,025 М KНРО + 0,025 М NaHPO) pH=6,88 и экстрагируют 3 раза по 30 см этилацетата. Полученную взвесь центрифугируют 15 мин при 4000 об./мин и декантиуют этилацетатный слой, промывают последовательно 5 см насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10%-ного NaOH; 5 мл насыщенного раствора NaCl с добавлением 0,2 мл 10%-ного СНСООН и 5 см насыщенного раствора NaCl. Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе (при 50 °С) до возможно минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха органических растворителей, добавляют 3 см смеси ацетонитрил-вода (1:4) и экстрагируют 3 раза по 5 см петролейного эфира, петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин экстракцией этилацетатом (3 раза по 5 см). Этилацетатный слой упаривают досуха, растворяют в 0,1 см метанола.