МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ИЗУЧЕНИЮ ЭМБРИОТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ
ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ ПРИ ГИГИЕНИЧЕСКОМ ОБОСНОВАНИИ ИХ ПДК
В ВОДЕ ВОДНЫХ ОБЪЕКТОВ

РАЗРАБОТАНЫ под руководством д.м.н. проф. Г.Н.Красовского, коллективом авторов: д.м.н. Г.Н.Красовским, к.м.н. 3.И.Жолдаковой, д.м.н. Ю.А.Рахманиным, к.м.н. Т.И.Бонашевской, м.н.с. Т.Г.Ламентовой (Институт Общей и коммунальной гигиены им. А.Н.Сысина АМН СССР); д.м.н. А.А.Королевым, к.м.н. Б.Р.Витвицкой, м.н.с. Н.А.Зайцевым (1 Московский медицинский институт им. И.М.Сеченова); к.м.н. В.Н.Фоменко, к.м.н. И.В.Силантьевой (Институт гигиены труда и профзаболеваний АМН СССР); к.м.н. В.А.Рязановой (МНИИ гигиены им. Ф.Ф.Эрисмана); д.м.н. Г.В.Селюжицким, к.м.н. В.В.Торопковым, к.м.н. Н.В.Волковой (Ленинградский санитарно-гигиенический медицинский институт); д.м.н. О.Г.Фроловой, к.м.н. Г.А.Шевелевой (Всесоюзный научно-исследовательский Центр по охране здоровья матери и ребенка МЗ СССР);

при участии: к.м.н. И.Н.Безкопыльного, д.м.н. Т.И.Искандарова, к.м.н. Д.Г.Красильщикова, асс. Г.Ю.Объедковой, д.м.н. Е.В.Штанникова;

с использованием материалов следующих авторов: м.н.с. М.Ю.Антомонова, м.н.с. Л.Ф.Астаховой, к.м.н. М.Т.Абашидзе, к.б.н. Д.В.Баличиевой, асп. Р.М. Бектемировой, к.м.н. С.П.Варшавской, врача В.Д.Гостинского, к.м.н. В.В.Иванова, м.н.с. Г.И.Леонской, д.б.н. Р.В.Меркурьевой, к.м.н. Л.В.Марцонь, асп. В.П.Муллиной, д.м.н. В.Г. Надеенко, к.м.н. Э.Г.Плотко, к.м.н. Е.М.Трофимовича, д.м.н. Б.М.Штабского.

УТВЕРЖДЕНЫ Зам. главного государственного санитарного врача СССР В.Е.Ковшило 22 сентября 1983 г. N 2926-83

Методические указания предназначены для научно-исследовательских институтов гигиенического профиля, гигиенических кафедр медицинских ВУЗов, отделов и лабораторий по охране окружающей среды различных министерств и ведомств.

Введение

Экспериментальное изучение отдаленных последствий воздействия на организм химических веществ является существенным разделом токсиколого-гигиенической оценки химического соединения при регламентировании допустимого содержания в окружающей среде. В комплексе биологических эффектов, относящихся к отдаленным последствиям воздействия химических факторов, важное значение имеет изучение влияния химических соединений в пренатальный период развития организма. В настоящее время накоплены многочисленные данные о возможном влиянии химических веществ на процессы эмбриогенеза. Выявление реальной и потенциальной опасности вредного действия химических веществ на плод в условиях эксперимента на лабораторных животных требует унифицированных методических подходов для выбора тест-объектов, испытуемых доз, продолжительности опыта и количественной оценки результатов.

Настоящие Методические указания составлены на основании опыта работы 19 учреждений страны и обобщения данных литературы в целях разработки единых методических подходов к исследованию эмбриотоксического эффекта и оценке степени опасности этого вида воздействия при обосновании допустимого уровня содержания химических веществ в воде водоемов. Накопленный материал по экспериментальному изучению эмбриотоксического эффекта в разных научно-исследовательских лабораториях позволяет в настоящее время разработать единую схему постановки опыта с учетом квалификации персонала, степени трудоемкости и затраты времени в серийном токсикологическом эксперименте. При подготовке настоящих Указаний учитывалось место эмбриотоксических исследований в схеме этапного проведения исследований по гигиеническому регламентированию химических веществ в водной среде. Методические Указания призваны способствовать внедрению в практику гигиенического нормирования унифицированной схемы изучения эмбриотоксического эффекта и получению репрезентативных данных, необходимых для объективной сравнительной оценки результатов.

Основные понятия и термины

Эмбриотоксичность - потенциальная возможность вещества оказывать отрицательный эффект на потомство во время начального периода беременности, т.е. в период между зачатием и образованием эмбриона.

Тератоген - вещество, при воздействии которого на организм во время беременности возникают пороки развития и (или) отклонения в постнатальном развитии у потомства.

(Англо-русский глоссарий избранных терминов по профилактической токсикологии. Москва, 1981, Программа ООН по окружающей среде ЮНЕП).

1. Общие требования к проведению исследований по оценке
эмбриотоксического и тератогенного действия химических веществ

1.1. Принципы изучения

При изучении эмбриотоксического действия химических веществ при их гигиеническом нормировании необходимо руководствоваться следующими принципами:

- возможность экспериментального воспроизведения эмбриотоксического эффекта на лабораторных животных;

- зависимость эффекта от дозы с установлением пороговости эмбриотоксического эффекта;

- этапность исследований при использовании традиционных и специальных методов оценки действия химического соединения на пренатальный период развития с установлением при этом обязательного и дополнительного объема исследований;

- приоритетность выбора методов оценки эмбриотоксического действия химических веществ на основе следующей классификации: обязательные и дополнительные методы исследования.

1.2. Выбор адекватной модели для изучения
эмбриотоксического и тератогенного действия химических веществ

Наиболее удобной моделью являются белые беспородные крысы ввиду небольшой длительности беременности, высокой плодовитости (8-12 плодов), простоты определения первого дня беременности. Существенным является и тот факт, что крысы и человек имеют одинаковый гемохориальный тип плаценты; у крыс в отличие от мышей редко возникают спонтанные аномалии развития.

2. Изучение эмбриотоксического действия химических веществ

Изучение эмбриотоксического эффекта требует специальной серии опытов с использованием достаточно большого количества животных. В каждом конкретном случае определяется целесообразность и объем исследований. Эти исследования необходимы:

- для новых или недостаточно изученных классов химических соединений;

- для соединений, оказывающих влияние на функцию гонад, для мутагенов и канцерогенов или близких к ним по химическому строению соединений;

- для химических соединений, характеризующихся по данным литературы легким и быстрым проникновением через плацентарный барьер;

- при наличии сведений об эмбриотоксичности вещества при обосновании ПДК его в других областях гигиенического нормирования.

В настоящее время существуют расширенные списки веществ, обладающих эмбриоторопным действием, согласно которому целый ряд веществ обладают выраженными эмбриотоксическими свойствами и относятся к различным группам химических соединений: химические канцерогены, углеводороды, соединения серы, хлорированные углеводороды, амиды, амины, имины, тяжелые металлы, хлор- и фосфорорганические соединения; лекарственные препараты: гормональные, антибиотики, снотворные, седативные, транквилизаторы, противоопухолевые препараты.

2.1. Этапы изучения эмбриотоксического действия химических веществ

Эксперименты по изучению эмбриотоксичности не проводятся, если достаточно твердо установлено экспериментальным или расчетным методом, что изучаемое вещество относится к IV классу опасности и лимитирующим признаком вредности при обосновании ПДК будет органолептический или общесанитарный показатель.

Эмбриотоксические исследования следует проводить для веществ I-III классов опасности в самостоятельных опытах на II-м этапе схемы обоснования ПДК. Если не выявлено эмбриотоксическое действие в дозах, превышающих более чем на порядок общетоксический эффект, или в результате этого опыта, установлено, что пороговая концентрация по эмбриотоксическому действию оказалась выше пороговой по общетоксическому действию в 10 и более раз, то данный раздел исследований можно считать завершенным. При совпадении пороговых доз по одному и другому эффекту необходимо проведение углубленных исследований по изучению специфичности эмбриотоксического эффекта с применением дополнительных методов и испытания доз на 1-2 порядка ниже максимально недействующей дозы, установленной в хроническом опыте по общетоксическому действию. Если в последующем установлено, что эмбриотоксический эффект является ведущим при обосновании ПДК, то необходимы специальные исследования с введением вещества в критические и чувствительные периоды беременности и изучения функционального состояния потомства до периода половой зрелости.

2.2. Обязательные методы оценки эмбриотоксического действия химических веществ

2.2.1. Методика постановки эксперимента

В опытах используются клинически здоровые интактные животные (половозрелые самки и самцы) в репродуктивном возрасте, все животных 180-240 г. Количество животных должно быть не менее 10 животных в каждой опытной группе, в контрольной группе и в группе сравнения. Группа сравнения позволяет обнаружить отличия в поражении беременного и небеременного организма. При отборе для опыта крыс-самок в ряде случаев рекомендуется изучение у них эстрального цикла по методике И.П.Западнюк (1962) - окрашивание вагинальных мазков метиленовой синью с последующей оценкой состояния цикла по 4-м стадиям эструса в зависимости от элементов мазков. Спаривание производится в конце рабочего дня, при этом самцы подсаживаются к самкам в соотношении 1:2 или 1:3. Первый день беременности устанавливается на основании обнаружения у нормально циклирующих самок сперматозоидов в вагинальном мазке. Мазок из влагалища крысы берут каждый раз новым слегка увлажненным тонкослойным ватным тампоном на заостренной спичке или стеклянной глазной палочкой, которую промывают после каждого взятия мазков в двух стаканчиках с водой. Мазок делают на обезжиренном предметном стекле, тщательно растирая содержимое тампона в капле обычной или дистиллированной воды. Препарат тотчас микроскопируют неокрашенным под малым увеличением. При обнаружении сперматозоидов производят маркировку, определяют массу тела крысы, отсаживают ее в отдельную клетку и начинают отсчет срока беременности. С 1-го по 21-й день беременности проводят пероральное введение изучаемого вещества в дозе, соответствующей задаче эксперимента, определяют прирост массы тела беременных животных на 1, 8, 14 и 21 сутки беременности. На 21-й день беременности крыс умерщвляют для последующих исследований согласно "Правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных" (Приказ N 755 МЗ СССР от 12.07.77). При выявлении тератогенного эффекта желательно провести новую серию опыта с введением вещества в критические периоды эмбриогенеза с учетом органотропности изучаемого химического соединения и сроков закладки соответствующих органов и систем. В этой серии предусматривается проведение однократных затравок в периоды наибольшей чувствительности морфогенетических систем к определенному токсическому агенту, последующий забой животных проводят на 21-е сутки.

2.2.2. Методика взятия эмбрионального материала

Перед умерщвлением определяют массу тела беременной крысы, затем производится вскрытие. Необходимый инструментарий для этого: большие и малые ножницы, анатомический и глазной пинцеты, линейка, измеритель, весы, чашки Петри с увлажненной фильтровальной бумагой.

При вскрытии беременных крыс следует избегать условий, приводящих к механическим повреждениям плодов. После вскрытия осторожными движениями проводят пальпаторное обследование рогов матки с подсчетом количества плодов и мест резорбций. Выделяют правый и левый яичники, тщательно очищают их от жировой ткани и помещают на увлажненную фильтровальную бумагу в чашке Петри, при этом в рабочем журнале заранее расчерчивают сетку для регистрации данных по левому и правому яичнику, что важно для точного определения показателя общей эмбриональной смертности при сопоставлении количества желтых тел беременности в яичнике и плодов в соответствующем роге матки. Осторожно вскрывают рога матки по наружному краю и освобождают плоды от околоплодных оболочек и отделяют от плаценты, пережимая при этом пуповину на 2-3 сек пинцетом. Подсчитывают число живых, мертвых, резорбированных плодов, количество мест имплантаций. Живые плоды реагируют на механическое воздействие. На лотке в последовательном порядке соответственно из левого и правого рогов матки располагают плоды и плаценты. Затем производят определение кранио-каудального размера плодов, массу тела плодов и плаценты. Данные при вскрытии каждой беременной крысы записываются в протокол (схема в приложении).

Для выявления патологии внутренних органов две трети количества плодов фиксируют в растворе Буэна, остальную часть плодов фиксируют в 96° спирте для изучения стадий окостенения скелета. Количество желтых тел беременности в яичниках, подсчитывают с помощью лупы и тонкой иглы; резорбции определяют визуально. Резорбированные зародыши имеют вид точечных образований, симметрично расположенных по наружным краям рогов матки; в случае гибели эмбрионов на более поздних стадиях - резорбции имеют вид округлых гомогенных тел диаметром 2,5-3 мм.

2.2.3. Учет показателей эмбриотоксического эффекта

Первичной экспериментальной единицей наблюдения для статистического расчета является один помет, т.е. количество беременных крыс на одну испытанную дозу, с учетом и последующей оценкой информации внутри его. На основании результатов вскрытия определяют следующие показатели по формулам А.М.Малашенко, М.К.Егоровой (1967), lyon М.F. et al (1974).

1) Общая эмбриональная смертность (%)      

2) Гибель эмбрионов до имплантации (%)

3) Гибель эмбрионов после имплантации (%)      

4) Показатель внутриутробной выживаемости (%)

5) Показатель индуцированной гибели эмбрионов (%)

,

     
где - число живых эмбрионов;

- число мертвых эмбрионов и число резорбций;

- количество желтых тел беременности.

6) Плодово-плацентарный индекс :

масса плаценты: масса плода - показатель полноценности функционирования фето-плацентарного комплекса и нарушения развития плода и плаценты.

7) Количество живых плодов на одну самку.

8) Индекс оплодотворения (%):

(кол-во забеременевших самок):(кол-во оплодотворенных)х100 самок

9) Определение показателя соотношения количества самок и самцов в помете проводится только в тех случаях, когда опытная группа чрезвычайно велика (не менее 1000 животных). Анализ эмбрионального материала проводится по показателям, представленным в таблице N 1 (в приложении).

Одновременно при проведении этих исследований визуально оценивается возможный тератогенный эффект. Если даже при действии максимально испытанных доз тератогенный эффект макроскопически не обнаруживается, дополнительные исследования не проводятся.

При обнаружении признаков тератогенного действия или при вариантах, отмеченных в пункте 2.1., проводятся исследования с целью изучения тератогенного эффекта.

3. Изучение тератогенного действия

К тератогенному эффекту относят все гистоморфологические дефекты развития, биохимические, функциональные и другие нарушения функции органов и систем, проявляющиеся в постнатальном периоде развития (И.В.Саноцкий, 1979). По классификации ВОЗ, тератогенность является видом эмбрио-фетальной токсичности и характеризуется постоянными структурными аномалиями, обусловленными пренатальной экспозицией токсических соединений. Любые нарушения роста, веса, выживаемости, а также отклонения в эмбриогенезе следует рассматривать как аномалии развития, которые могут быть общими, локальными, функциональными. Повреждение плода может быть в целом, отдельных частей или органов, или нарушения функции.

Аномалии могут быть общими (отставание в весе, в развитии, отеки, расширение сосудистой сети, гематомы точечные и обширные и другие). Внешний осмотр плодов проводят с помощью лупы от головы к хвосту. Осмотр черепа в профиль и в анфас дает возможность определить водянку мозга. При осмотре глаз отмечают наличие их, размеры, расположение. Отмечают комбинированные дефекты черепа и мозга; морду плода следует осматривать в анфас для обнаружения надрезов или трещин, указывающих на расщелину неба, нижней челюсти, лицевых костей. Расщелину неба, если она большая, можно увидеть, вставив в рот глазной пинцет и слегка раздвинув челюсти. Незаконченная форма расщелины неба может быть обнаружена только при микроанатомическом сечении. Аномалии внешнего уха могут проявляться отклонениями в размере, форме и положении. Аномалии конечностей обычно проявляются необычным их размером или положением пальцев. Аномалии туловища могут проявляться в виде пупочной грыжи, незаращении передней стенки и других отклонений. Если отсутствует несколько позвонков выше хвоста, то туловище выглядит короче и закругленнее обычного. Довольно часто отмечаются аномалии хвостовых позвонков, в результате чего хвост либо отсутствует, либо короткий, свернутый кольцом или изогнут под углом. Дефектом позвоночника является также заращение анального отверстия.

3.1. Проведение исследований для выявления патологии внутренних органов

21-дневные плоды фиксируют в жидкости Буэна, состоящей из перенасыщенного раствора пикриновой кислоты, 40% формалина и ледяной уксусной кислоты в соотношении 15:5:1 соответственно. Через 7 дней фиксированные эмбрионы переносят в 70° спирт, где они могут сохраняться в течение длительного периода времени. Качество эмбрионального материала при выполнении этих исследований во многом определяется объемом фиксатора, рекомендуется брать 25 мл жидкости Буэна на один плод. Перед проведением исследований для выявления внутренней патологии плоды вынимают из банки, в течение 10 минут отмачивают в воде для удаления раздражающих паров фиксатора и затем подвергают микроанатомическому сечению. Для целей исследования плоды разрезают бритвой по 9-ти сагитальным срезам, которые тщательно изучают с помощью бинокулярной лупы (Вильсон, 1965 в модификации А.П.Дыбана, 1967).