МУ 1.3.1794-03

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ


1.3. ЭПИДЕМИОЛОГИЯ

Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала,
инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности

     

Дата введения: с момента утверждения

1. РАЗРАБОТАНЫ: Департаментом госсанэпиднадзора Минздрава России (М.П.Шевырева, Ю.М.Федоров); Центром по генной диагностике особо опасных инфекционных заболеваний Минздрава России на базе Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (В.В.Кутырев, А.Н.Куличенко, Н.А.Осина, И.Н.Шарова, М.Н.Ляпин, И.Г.Дроздов); Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Е.Н.Беляев, И.В.Брагина, А.А.Ясинский, Э.Ф.Опочинский, Т.В.Воронцова, М.В.Зароченцев); ЦНИИ эпидемиологии Минздрава России (В.И.Покровский, Н.А.Семина, Г.А.Шипулин, Е.Н.Родионова); Противочумным центром Минздрава России (В.Е.Безсмертный, С.М.Иванова, Ю.А.Панин); ГИСК им. Л.А.Тарасевича (Т.А.Бектимиров, Р.А.Волкова, М.С.Воробьева, Л.В.Саяпина); Ростовским-на-Дону научно-исследовательским противочумным институтом (И.Ю.Сучков, С.О.Водопьянов, Б.Н.Мишанькин); Ставропольским научно-исследовательским противочумным институтом (Е.И.Еременко, А.Ф.Брюханов, О.И.Цыганова); Иркутским научно-исследовательским противочумным институтом (С.В.Балахонов, М.Ю.Шестопалов); ГНЦ биотехнологии и вирусологии "Вектор" (Г.М.Игнатьев, Н.Л.Максимов, А.А.Неверов, В.А.Терновой, С.В.Нетесов); Биоком (А.Б.Комаров).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации (протокол N 20 от 2 декабря 2003 г.).

3. УТВЕРЖДЕНЫ И ВВЕДЕНЫ В ДЕЙСТВИЕ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 5 декабря 2003 г.

4. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения

1.1. Методические указания предназначены для органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, а также могут быть использованы юридическими лицами, независимо от организационно-правовых форм и форм собственности, и индивидуальными предпринимателями, выполняющими в установленном порядке работы с объектами и материалами, содержащими или подозрительными на содержание микроорганизмов I-II групп патогенности:

- диагностические (исследование объектов окружающей среды и клинического материала, в том числе от больных с подозрением на ТОРС);

- экспериментальные;

- производственные (работы по производству и контролю генодиагностических препаратов при условии соблюдения требований GMP).

1.2. Методические указания определяют принципы организации лабораторий и этапы выполнения ПЦР-анализа: взятие проб, первичная обработка, хранение, условия транспортирования, обеззараживание материала, выделение нуклеиновых кислот, проведение ПЦР (ОТ-ПЦР), учет и регистрация результатов при исследовании биологического материала, пищевых продуктов, материала из объектов окружающей среды.

1.3. Методические указания регламентируют выполнение исследований с использованием ПЦР-анализа, осуществляемого сертифицированными тест-системами и оборудованием и предусматривающего учет результатов методом электрофореза или гибридизационно-ферментного анализа (ГиФА).

2. Нормативные ссылки

2.1. Санитарно-эпидемиологические правила "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" СП 1.3.1285-03.

2.2. Санитарно-эпидемиологические правила "Порядок выдачи санитарно-эпидемиологического заключения о возможности проведения работ с возбудителями инфекционных заболеваний человека I-IV групп патогенности (опасности), генно-инженерно-модифицированными микроорганизмами, ядами биологического происхождения и гельминтами" СП 1.2.1318-03.

2.3. Санитарные правила и нормы "Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений" СанПиН 2.1.7.728-99.

2.4. Методические указания "Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР" МУ 3.5.5.1034-01. М., 2001.

2.5. "Методические указания по детекции патогенной микрофлоры в клиническом материале, пищевых продуктах, объектах внешней среды и генетической идентификации клеток с помощью полимеразной цепной реакции". Госкомсанэпиднадзор России от 18.10.96 N 01-19/123-17.

2.6. Методические указания "Лабораторная диагностика сибирской язвы у животных и людей, обнаружение возбудителя в сырье животного происхождения и объектах внешней среды". МЗ СССР от 01.09.86 и Госагропром СССР от 01.09.86.

2.7. Методические указания "Лабораторная диагностика холеры" МУ 4.2.1097-02. М., 2002.

2.8. Методические указания "Профилактика и лабораторная диагностика бруцеллеза у людей" МУ 3.1.7.1189-03. М., 2003.

2.9. Методические указания "Сбор, учет и подготовка к лабораторному исследованию кровососущих членистоногих - переносчиков возбудителей природно-очаговых инфекций" МУ 3.1.1027-01. М., 2002.

2.10. "Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции". М.,1995.

2.11. Временные методические рекомендации "Лабораторная диагностика "атипичной пневмонии" (SARS) методом ПЦР", утв. Минздравом России 03.05.03.

2.12. Руководство по профилактике чумы. Саратов: Слово, 1992.

2.13. Руководство "Использование ультрафиолетового излучения для обеззараживания воздуха и поверхностей в помещениях". Р 3.1.683-98, МЗ РФ.

2.14. Инструкция по проектированию санитарно-эпидемиологических станций СН 535-81. М.: Стройиздат, 1982.

3. Общие положения

3.1. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) основана на амплификации (многократном увеличении числа копий) фрагмента ДНК-мишени в условиях in vitro и позволяет обнаружить специфичный участок генома микроорганизма.

3.2. Аналитическая чувствительность тест-систем для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов методом ПЦР составляет 1х10-1x10 м.к. (геномных эквивалентов)/мл, специфичность - 85-100%, возможно исследование любого биологического материала и объектов окружающей среды, время выполнения анализа 4-8 ч.

3.3. Для выявления ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности ПЦР-анализ используют:

- в качестве экспрессного метода при исследовании материала от больного (подозрительного на заболевание) и индикации патогенных биологических агентов (ПБА) в объектах окружающей среды;

- как ускоренный предварительный тест при выполнении культурального и биологического методов исследования и для идентификации подозрительных культур;

- для определения эпидемиологической значимости изолятов на основании выявления генетических маркеров вирулентности, например, ctxA- и tcpA-генов у возбудителя холеры;

- эпидемиологического мониторинга;

- в научных целях для генотипирования штаммов или их ретроспективного анализа.

4. Требования к организации работ

4.1. Проведение исследований по выявлению ДНК (РНК) микроорганизмов I-II групп патогенности сопряжено с необходимостью одновременного обеспечения правил биологической безопасности работ и требований к организации и проведению ПЦР-анализа с целью предотвращения контаминации исследуемых проб нуклеиновыми кислотами (НК).

4.2. Противоэпидемический режим работы при ее организации и выполнении должен быть обеспечен в соответствии с СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)", регламентирующими работу с микроорганизмами I-II групп патогенности.

4.3. Все этапы исследования материала, зараженного или подозрительного на зараженность вирусами I группы, проводят в условиях максимально изолированных лабораторий с использованием изолирующих средств индивидуальной защиты или в боксах биологической безопасности III класса в защитном костюме IV типа, дополненном резиновыми перчатками.

4.4. Исследования материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности, методом ПЦР проводят в организациях, имеющих лицензию на деятельность, связанную с возбудителями инфекционных заболеваний человека, в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения соответствующих работ (с указанием конкретных видов микроорганизмов). В этой же лаборатории могут проводиться ПЦР-исследования с микроорганизмами III-IV групп патогенности.

4.5. Допускается проведение исследований крови методом ПЦР на бруцеллез, парентеральные вирусные гепатиты, ВИЧ-инфекцию в лабораториях, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с возбудителями III группы патогенности, выданное в установленном порядке.

4.6. Передачу исследуемого материала в другие организации проводят в соответствии с п.п.2.1.2 и 2.8.20 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

4.7. Работу по ПЦР-диагностике организует специалист с высшим образованием, прошедший обучение на лицензированных курсах специализации (повышения квалификации) по работе с ПБА I-II групп патогенности и по ПЦР-диагностике.

5. Требования к помещению и оборудованию ПЦР-лабораторий

5.1. Помещения, в которых проводят исследования на наличие НК микроорганизмов I-II групп патогенности, размещают в "заразной" зоне лаборатории, проводящей диагностические и другие исследования с указанными микроорганизмами. При наличии возможности помещения располагают в виде отдельного блока. При строительстве новых или реконструкции имеющихся помещений лабораторию ПЦР размещают в отдельно стоящем здании (изолированной части здании) с соблюдением требований СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)" и учетом особенностей устройства вентиляционной системы ПЦР-лаборатории, изложенных в п.5.19 настоящих методических указаний.

5.2. Рабочая зона ПЦР-лаборатории в соответствии с этапами ПЦР-анализа должна включать следующий минимальный набор последовательно расположенных самостоятельных помещений (прилож.1) или отдельно выделенных рабочих зон (в составе других функциональных помещений):

- приема, разборки, первичной обработки материала;

- подготовки проб, выделения нуклеиновых кислот (НК);

- приготовления реакционных смесей, проведения ПЦР и обратной транскрипции (ОТ);

- учета результатов методом электрофореза или ГиФА.

5.3. Комнату выделения НК располагают вблизи от комнаты приема материала, а помещение для учета результатов - по возможности в отдалении от других перечисленных помещений для обеспечения условий, исключающих занос в них продуктов амплификации (ампликонов) с воздушным потоком.

5.4. Не допускается выполнение ПЦР-исследований в помещениях для проведения работ с использованием культуральных (накопление патогенных биологических агентов) и генно-инженерных методов, в том числе связанных с получением (клонированием) и выделением рекомбинантных плазмид.

5.5. Зону приема, регистрации, сортировки, первичной обработки материала (объединение или разделение проб, центрифугирование, инактивацию и т.д.) располагают в комнате приема материала блока для работы с инфицированными животными или в отдельной боксированной комнате. В этих же помещениях может проводиться обработка проб к другим видам исследований (бактериологическое, вирусологическое, серологическое и т.д.). При наличии возможности в помещении устанавливают бокс биологической безопасности III класса защиты (допускается также использование бокса 2ШНЖ, например, фирмы "Изотоп" и др.) или бокс безопасности II класса защиты.

5.6. Зону по подготовке проб и выделению нуклеиновых кислот размещают в боксированном помещении (микробиологический бокс с предбоксом) или в комнате заражения и вскрытия животных. Работу проводят в боксе биологической безопасности II или III класса. В рабочей зоне располагают оборудование и предметы, необходимые только для предварительной обработки, выделения НК (примерный перечень представлен в прилож.2).

5.7. Зону приготовления реакционных смесей и проведения ОТ и ПЦР-амплификации располагают в боксированном помещении или боксе биологической безопасности II класса (или ПЦР-боксе) - для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР.

5.8. Работу по подготовке реакционных смесей для ПЦР и ОТ-ПЦР проводят до доставки в бокс проб, поступающих из зоны выделения НК. Смесь может быть приготовлена также за пределами помещений лаборатории, предназначенных для работы с заразным материалом, например, в комнате (боксе) для розлива питательных сред.

5.9. При необходимости этап подготовки проб и выделения нуклеиновых кислот может выполняться в одной комнате с этапом ПЦР при наличии в ней бокса биологической безопасности II или III класса защиты для выделения НК и бокса биологической безопасности II класса (или ПЦР-бокса) - для подготовки реакционных смесей для ОТ и ПЦР. Каждый бокс рассматривается как соответствующая рабочая зона.

5.10. Зону детекции результатов располагают в боксированном помещении. При отсутствии боксированного помещения работу проводят в отдельной комнате, при возможности в ПЦР-боксе.

5.11. При одновременном использовании двух методов детекции продуктов амплификации - электрофоретического и ГиФА - следует выделить отдельные помещения или две рабочие зоны. Оборудование и принадлежности для каждого вида анализа маркируют применительно к каждой зоне. Обмен посудой и пипетками между зонами не допускается.

5.12. Помещения ПЦР-лаборатории покрывают кафелем (пол, стены) или масляной краской (стены, потолок), устойчивой к действию моющих и дезинфицирующих средств.

5.13. Во всех помещениях устанавливают бактерицидные лампы. Рекомендуется дополнительная установка переносного ультрафиолетового бактерицидного облучателя-рециркулятора.

5.14. Окна должны быть плотно закрыты. Для защиты рабочих столов от попадания прямого солнечного света используют светозащитные пленки из материала, устойчивого к дезинфицирующим средствам. Использование жалюзи не рекомендуется из-за адсорбции пыли.

5.15. Каждая рабочая зона должна иметь свой набор мебели, лабораторного оборудования, реагентов, автоматических пипеток, наконечников, пластиковой и стеклянной посуды, защитной одежды, обуви, резиновых перчаток, уборочного инвентаря и пр., используемых только в данной комнате (рабочей зоне).

5.16. Имущество каждой рабочей зоны должно иметь маркировку указанной зоны. Применение его в других помещениях или для других видов исследований не допускается.

5.17. В рабочих зонах должен быть свой набор холодильников (прилож.2):

- в комнате приема материала от 4 до 8 °С, минус 20 °С и минус 70 °С (при необходимости длительного хранения материала);

- в комнате выделения нуклеиновых кислот от 4 до 8 °С и минус 20 °С для хранения набора выделения НК; от 4 до 8 °С - для хранения препаратов НК; не допускается хранение проб материала или препаратов НК в одном холодильнике с компонентами набора для выделения НК;

- в комнате ПЦР-амплификации от 4 до 8 °С и минус 20 °С - для хранения наборов обратной транскрипции и амплификации НК;

- в комнате детекции продуктов амплификации от 4 до 8 °С - для хранения наборов электрофоретической детекции и ГиФА.

5.18. Помещения ПЦР-лаборатории оборудуют приточно-вытяжной или вытяжной вентиляцией, соответствующей требованиям п.п.2.3.16 и 2.4.3 СП 1.3.1285-03 "Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности)".

5.19. При выполнении ПЦР воздухообмен внутри и между помещениями может повышать опасность контаминации проб из-за вероятности проникновение молекул НК и продуктов амплификации через фильтры. Снижение этой опасности достигается указанной ниже системой вентиляции лаборатории:

- следует полностью исключить воздухообмен между помещением для детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) и остальными комнатами ПЦР-лаборатории, а также другими помещениями организации (давление воздуха в пост-ПЦР-помещении должно быть ниже, чем в указанных помещениях);