МУ 3.2.1173-02

     
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

     

3.2. ПРОФИЛАКТИКА ПАРАЗИТАРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

     
Серологические методы лабораторной диагностики
паразитарных заболеваний

     

Дата введения 2003-02-01

1. РАЗРАБОТАНЫ: Институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И.Марциновского ММА им. И.М.Сеченова (В.П.Сергиев, О.Г.Полетаева, Т.В.Продеус, Э.Е.Шуйкина, Е.А.Коврова, Н.Н.Красовская), кафедра паразитологии, паразитарных и тропических болезней МПФ ППО ММА им. И.М.Сеченова (Т.В.Старкова, Н.А.Романенко), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Т.Н.Цыбина, Т.Г.Сыскова, Л.Г.Подунова, Т.А.Семенова), Российской Академией последипломного образования (А.Я.Лысенко, Т.Н.Константинова, Т.И.Авдюхина, А.Е.Беляев, М.Г.Владимова), НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалея (А.Л.Гинзбург, А.И.Грачева), Омским НИИ природно-очаговых инфекций (О.Ю.Старостина, В.К.Ястребов), Ростовский НИИ микробиологии и паразитологии (Ю.И.Васерин, Т.И.Твердохлебова), Тюменским НИИ краевой и инфекционной патологии (Т.Ф.Степанова, Т.В.Постникова, К.Б.Степанова), Всероссийским НИИ гельминтологии им. К.И.Скрябина (А.В.Успенский, А.С.Бессонов, Н.В.Шеховцов), ЗАО "Вектор-Бест" (А.В.Масяго).

2. УТВЕРЖДЕНЫ Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г.Онищенко 14 ноября 2002 г.

3. ВВЕДЕНЫ ВПЕРВЫЕ.

1. Область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают основные методы серологической диагностики паразитарных заболеваний, проводимые аккредитованными, лицензированными лабораториями лечебно-профилактических учреждений, органов и учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы, ведомственных учреждений, научно-исследовательских учреждений и других диагностических (испытательных) лабораторий вне зависимости от ведомственной принадлежности и форм собственности.

1.2. Методические указания предназначены для специалистов лабораторий, выполняющих серологические исследования на паразитарные заболевания и использующих медицинские иммунобиологические препараты (МИБП) отечественного и зарубежного производства, зарегистрированные на территории Российской Федерации и разрешенные к применению Министерством здравоохранения Российской Федерации.

2. Нормативные ссылки

- Федеральный закон Российской Федерации "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения" N 52-ФЗ от 30.03.99.

- Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации, утвержденное постановлением Правительства РФ N 554 от 24.07.00.

- Положение о санитарно-эпидемиологическом нормировании, утвержденное постановлением Правительства РФ N 554 от 24.07.00.

- СанПиН 3.2.569-96 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации"*.

_______________

* Действуют СанПиН 3.2.1333-03. - Примечание изготовителя базы данных.

- СП 3.1/3.2.558-96 "Общие требования по профилактике инфекционных и паразитарных заболеваний"*.

_______________

* Действуют СП 3.1/3.2.1379-03. - Примечание изготовителя базы данных.

- СП 1.2.731-99 "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности и гельминтами".

- СП 3.3.2.561-96 "Государственные испытания и регистрация новых лекарственных иммунологических препаратов".

- ОСТ 91 500.05.001-00 "Стандарты качества лекарственных средств".

- МУ 2.1.4.1057-01 "Организация внутреннего контроля качества санитарно-микробиологических исследований воды".

3. Отбор проб, хранение и транспортирование материала
для серологических исследований

Материалом при иммунологических исследованиях может быть биологический материал от людей (сыворотка крови, слюна, фекалии), а также материал из объектов окружающей среды (почва, вода и др.).

Для выявления антител к антигенам гельминтов и простейших у людей иммунологическими методами в настоящее время используется сыворотка крови обследуемого человека.

3.1. Забор крови на исследование проводится по общепринятым гематологическим методикам (забор венозной крови проводят в процедурных кабинетах лечебно-профилактических учреждений (ЛПУ), капиллярной крови - в диагностических лабораториях ЛПУ и других аккредитованных лабораториях).

3.2. Подготовка сыворотки проводится в лабораториях.

3.2.1. Кровь в пробирке отстаивают в течение 1-2 ч при комнатной температуре или 0,5-1 ч при 37 °С в термостате, предварительно отслоив стерильной пастеровской пипеткой или стеклянной палочкой сгусток от краев пробирки. Для лучшей ретракции сгустка пробирку помещают в холодильник при 4 °С на 1-2 ч или центрифугируют 10 мин при 3000 об./мин или 20 мин при 1500 об./мин. Сыворотку отсасывают стерильной пипеткой в стерильные стеклянные пробирки (ампулы, флаконы) или полистироловые микропробирки типа "Эппендорф" с крышками.

При массовых обследованиях населения ампулы с сывороткой перед транспортированием и хранением запаивают, избегая нагревания сыворотки, флаконы закрывают стерильными резиновыми пробками, микропробирки закрывают крышками. Ампулы, флаконы, микропробирки нумеруют согласно приложенному списку больных (обследуемых) или этикетируют с указанием фамилии, имени, отчества больного, даты взятия крови.

3.3. Хранение, транспортирование крови и сыворотки.

Кровь доставляется в лабораторию в день взятия. В этот же день из нее должна быть подготовлена сыворотка, которая может храниться до исследования в холодильнике при 2-4 °С не более 4-6 дней. При длительном хранении (более 2-х недель) сыворотку необходимо хранить в замороженном виде при температуре - 20-25 °С, допускается глубокое замораживание до - 70 °С. Не допускается замораживание и размораживание сыворотки более 1 раза.

Длительное хранение сывороток приводит к частичной потере активности антител, особенно иммуноглобулинов класса М (IgM).

При массовом заборе крови от населения, при длительном хранении сывороток до исследования (в течение года) и с целью предупреждения потери активности антител, необходимо хранить сыворотки в глубоком холоде, при температуре не выше - 20-40 °С.

До замораживания сыворотку от одного обследуемого можно разлить в несколько полистироловых микропробирок с крышками типа "Эппендорф", что позволяет размораживать не всю сыворотку, а ее отдельную часть.

Транспортирование замороженных сывороток должно быть при тех же температурных условиях, не допускающих размораживания (в сумках-холодильниках или термосах со льдом, можно использовать сухой лед).

Сыворотку перед исследованием необходимо разморозить полностью и тщательно перемешать во избежание потери концентрации антител.

4. Общие сведения о инвазиях, выявляемых серологическими методами

В клинической практике серологические методы исследования являются дополняющими к комплексу клинико-инструментальных (эхинококкозы, цистицеркоз, токсокароз) и паразитологических (описторхоз, трихинеллез) показателей для целей дифференциальной диагностики паразитарного заболевания от заболевания со сходной клинической картиной. Серологическая диагностика применяется с целью выявления инвазированных, для оценки эффективности специфической терапии инвазированных, выявления рецидива заболевания.

4.1 Основные гельминтозы, выявляемые серологическими методами

Трихинеллез. Возбудитель нематода Trichinella spiralis и ее вариитеты. Острое заболевание, сопровождающееся лихорадкой, развитием отеков, миалгией и эозинофилией крови. При тяжелом течении возможно поражение миокарда, центральной нервной системы. Серологическая диагностика трихинеллеза осуществляется с учетом штаммовых особенностей возбудителя заболевания, а также состояния иммунной системы инвазированного. Выработка специфических антител происходит в период миграции личинок трихинелл и концентрации их в мышцах. Их выявление в серологических реакциях у лиц, заразившихся при употреблении в пищу мяса домашних животных (свиньи) с высокой или средней интенсивностью инвазии трихинеллами (200-500 личинок на 1 г мяса) происходит на 15-20 сутки после заражения. При меньшей интенсивности инвазии сроки выявления антител удлиняются. При заражении людей от диких животных (медведь, кабан, барсук, нутрия) антитела выявляются спустя 4-6 недель. В течение 2-4 месяцев показатели серологических реакций могут нарастать. Через 4-5 месяцев после заражения эти показатели снижаются, однако остаются на диагностическом уровне не менее 1,5 лет, а при интенсивном заражении до 2-2,5 и более лет.

Для ранней серологической диагностики трихинеллеза желательна одновременная постановка двух серологических реакций, например, одновременно реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и иммунноферментного анализа (ИФА). Совпадение их результатов свидетельствует о правильности диагноза.

Чувствительность ИФА и РНГА достигает 90-100%, а специфичность - 70-80%. Результаты двух реакций совпадают в 80-90% случаев. Ложноположительные результаты анализа чаще наблюдаются при острой фазе ряда гельминтозов (описторхоз, клонорхоз и др.), в связи с чем для дифференциального диагноза требуется тщательное изучение клинико-эпидемилогического анамнеза. Серологический диагноз трихинеллеза ставится на основании 4-кратного прироста титра антител. При невозможности исследования сыворотки в начале заболевания, исследуется сыворотка крови, полученная в период реконвалесценции. У больных с подозрением на трихинеллез, при первичном получении отрицательного или сомнительного результата реакции, исследование крови необходимо повторить через 10-14 дней, нарастание титров подтверждает инвазию трихинеллами.

Специфическая терапия трихинеллоцидными препаратами вызывает подъем титров антител, которые сохраняются в диагностических значениях на протяжении 6-12 месяцев, а затем снижаются. У лиц с подозрением на трихинеллез и получавших превентивное лечение серологическое обследование проводят через 2-3 недели после лечения. У переболевших трихинеллезом антитела сохраняются в течение длительного времени - от 2-х и более лет.

При массовых обследованиях населения на трихинеллез сыворотки крови исследуют в одном диагностическом разведении методом скрининга, как указывается в инструкциях к тест-системе ИФА и диагностическому набору РНГА. В случае положительного результата анализа у обследованных и при наличии у них клинической картины трихинеллеза, сыворотку титруют в последовательных двукратных разведениях, начиная от диагностического.

Показания к серологическому обследованию:

- наличие клинических симптомов (лихорадка неясного генеза, отек лица, миалгия, эозинофилия и др.); при миокардитах, менингоэнцефалитах неясного генеза, при лейкемоидной реакции по эозинофильному типу неясного генеза у пациентов, употреблявших в пищу свинину, медвежатину, кабана и мясо других животных - потенциальных хозяев трихинелл;

- расшифровка случаев групповой заболеваемости трихинеллезом (вспышки) и выявление контактных на эндемичных территориях (на неэндемичных территориях: при наличии в эпиданамнезе указаний на употребление в пищу мяса и мясопродуктов из свинины, медвежатины и других животных - потенциальных хозяев трихинелл).

Описторхоз. Возбудитель трематода Opisthorchis felineus. Tpeматодоз печени, протекающий на ранней стадии в виде острого аллергоза с высокой эозинофилией крови, на поздней - с преимущественным поражением гепатобилиарной системы, с умеренно повышенным или нормальным уровнем эозинофилов.

Серологическая диагностика описторхоза на ранней фазе заболевания, до начала яйцепродукции паразитом, является единственным методом лабораторной диагностики, при хроническом описторхозе является вспомогательным методом, при котором требуется подтверждение паразитологическими методами диагностики. Чувствительность реакции (ИФА и РНГА) в острую фазу приближается к 100%, в хронической фазе заболевания - до 70%, и зависит от интенсивности инвазии. Ложноположительные результаты анализа возможны при исследовании сыворотки здоровых лиц в 1,0%, больных непаразитарными заболеваниями (аллергозы, патология желудочно-кишечного тракта, гепатобиллиарной системы, системные заболевания) - в 1,5%, токсоплазмозом - в 5,6%, токсокарозом - в 7,3%, эхинококкозом - в 15,4%, трихинеллезом - в 20,0%, фасциолезом - в 29,4% случаев.

В очагах описторхоза у коренных жителей наблюдаются низкие показатели серологических реакций вследствие врожденной толерантности. У пришлого населения (рабочие-вахтовики, переселенцы и др.) вследствие отсутствия врожденной невосприимчивости к заражению описторхисами, как правило, регистрируются высокие показатели серологических реакций.

При серодиагностике возможно получение ложноотрицательных результатов на фоне иммунодефицитных состояний вследствие сопутствующих хронических заболеваний или индуцированных приемом медикаментов (антибиотиков, глюкокортикостероидов, химиопрепаратов).

Показания к серологическому обследованию:

- высокая эозинофилия крови или лейкемоидная реакция по эозинофильному типу у лиц, употреблявших в пищу речную рыбу;

- лица, работавшие или проживавшие в эндемичных по описторхозу районах, а в настоящее время страдающие заболеваниями желчевыводящих путей.

Эхинококкозы. Возбудитель однокамерного эхинококкоза - личиночная форма цестоды Echinococcus granulesus, многокамерного эхинококкоза - Echinococcus multilocularis. Тяжелые, хронически протекающие гельминтозы с поражением печени и других органов, приводящие в части случаев к инвалидизации и летальным исходам.

Серологические реакции при эхинококкозах используют для первичной диагностики, для оценки результатов оперативного и консервативного лечения и наблюдения за больными в динамике, для раннего выявления рецидивов заболевания. Локализация и жизнеспособность ларвоцист эхинококка гидатидозного и альвеолярного, интенсивность инвазии, а также состояние иммунной системы хозяина влияют на интенсивность антителообразования и выявляемость инвазированных с помощью серологических реакций.

Наиболее эффективными для диагностики эхинококкозов являются реакции РНГА и ИФА, с помощью которых выявляются до 90-98% инвазированных, независимо от видовой принадлежности паразита. Совпадение двух реакций наблюдается в 90% случаев. Максимальная выявляемость эхинококкозов серологическими методами (до 98%) наблюдается при локализации эхинококковых пузырей живого паразита в печени, брюшной полости и забрюшинном пространстве, а также при множественном и сочетанном поражении. При поражении легких, а также при наличии 1-3 кист небольшого (до 2 см) размера эффективность серологической диагностики ниже и колеблется в пределах 70-80%. Наименее информативны серологические методы диагностики при эхинококкозе нервной (спинной или головной мозг, глаз), мышечной или костной ткани, а также при погибшем и обызвествленном паразите. В этом случае чувствительность диагностических препаратов не превышает 40%. При серологической диагностике эхинококкозов возможна регистрация ложноположительных результатов, возникающих при наличии в крови неспецифических антител, сходных по структуре с антителами к эхинококку. Наиболее часто ложноположительные результаты выявляются при соматических и инфекционных заболеваниях, сопровождающихся обширными деструктивными процессами в пораженных органах (цирроз печени, туберкулез легких и других тканей, онкологические заболевания). Возникновение ложноположительных реакций возможно при других гельминтозах (описторхоз, фасциолез и цистицеркоз).

Низкие титры антител могут быть выявлены в ранний период болезни (кисты диаметром до 2 см), а также при обызвествленных оболочках ларвоцист; резкое снижение титров может наблюдаться при далеко зашедшем процессе, в поздней, неоперабельной стадии эхинококкозов. Высокие титры антител могут быть выявлены у больных с активным процессом, чаще локализованном в органах брюшной полости; в случае легочной локализации кисты эхинококка (даже при наличии кисты больших размеров) титры антител могут быть низкими.

Показания к серологическому обследованию:

- наличие объемного образования или кист в печени и других органах;

- эпидзначимые контингента - лица, относящиеся к группам риска (охотники и члены их семей; зоотехники; чабаны и пастухи; работники кожевенных предприятий и т.д.), лица, проживающие в очагах эхинококкозов.

Токсокароз - вызывается мигрирующими личинками аскаридат собак Toxocara canis. Инвазия с длительным рецидивирующим течением, полиморфными клиническими проявлениями и высокой эозинофилией периферической крови.

Серологическая диагностика токсокароза основана на результатах реакции ИФА с антигеном токсокар при исследовании сыворотки крови у лиц с характерным комплексом симптомов: лимфаденопатия, гепатомегалия, бронхит, бронхиальная астма неясного генеза, уртикарная сыпь на фоне эозинофилии крови, лейкемоидная реакция эозинофильного типа с характерным эпиданамнезом (например: геофагия) и др.

У пациентов, имеющих симптоматику, характерную для токсокароза, титры антител (AT) в ИФА 1:800 и выше подтверждает клинический диагноз. У лиц при отсутствии клинической симптоматики титр AT в ИФА 1:400 и ниже свидетельствует о контакте человека с возбудителем без развития патологического процесса. Ложноположительные результаты анализа могут наблюдаться у лиц с системными лимфопролиферативными заболеваниями и нарушениями в системе иммунитета. Это определяет необходимость проведения анализа клинической картины заболевания. Ложноотрицательный и сомнительный результат анализа может наблюдаться у лиц с поражением токсокарами глаз в результате слабого антигенного воздействия. Лиц с низким положительным результатом ИФА (титр 1:200-1:400) ставят на диспансерный учет и каждые 3 месяца проводят серологическое исследование. При появлении клинической картины заболевания и повышения титров специфических AT, врач принимает решение о необходимости проведения лечебных мероприятий.

4.2. Основные протозоозы, выявляемые серологическими методами

Токсоплазмоз. Возбудитель внутриклеточные простейшие Toxoplasma gondii. Широко распространенное протозойное заболевание, характеризуется полиморфизмом клинических проявлений от бессимптомного носительства до выраженных клинических проявлений. Серологическая диагностика токсоплазмоза осуществляется с помощью ИФА для выявления IgM- и IgG-антител и реакции иммунофлюоресценции (РИФ). Является важной для дифференциальной диагностики от заболеваний со сходной клинической картиной. Сроки выявления специфических антител и кинетика смены концентраций иммуноглобулинов обоих классов индивидуальны, и зависят от интенсивности инвазии и иммунного статуса инвазированных. В ряде случаев выявление иммуноглобулинов класса IgM в РИФ и ИФА наблюдается через 7-12 суток после заражения в невысоких титрах. Через 2-3 месяца эти показатели достигают максимума, а через 3-4 месяца исчезают. Концентрация антител, относящихся к иммуноглобулинам класса IgG, достигает максимума к концу 2 месяца инвазии, затем снижается, но остается повышенной в течение всей жизни инвазированного.

Рекомендуется повторное обследование лиц с положительными титрами на токсоплазму через 10-14 суток, для установления динамики развития болезни. Отсутствие увеличения титров антител свидетельствует о хроническом токсоплазмозе. Увеличение титров на 3-4 разведения сыворотки свидетельствует об активном течении инвазии. Возможна иная схема кинетики выявления в РИФ и ИФА иммуноглобулинов классов М и G.