ГОСТ Р 51484-99 Масла растительные и жиры животные. Метод определения состава жирных кислот в положении 2 в молекулах триглицеридов

     8 Проведение определения

8.1 Нейтрализация пробы гидроокисью натрия

Растворяют (10±1) г испытуемой пробы в 100 см гексана или легкого петролейного эфира (5.1.2) и переносят раствор в делительную воронку (6.1.5). Приливают 50 см изопропилового или этилового спирта (5.1.1), несколько капель раствора фенолфталеина (5.1.5) и объем гидроокиси натрия (5.1.4), эквивалентный содержанию свободных жирных кислот жира или масла, с избытком 0,5%. Тщательно перемешивают в течение 1 мин и приливают 50 см воды, вновь перемешивают и дают отстояться. После разделения слоев сливают нижний слой, содержащий мыло, и промежуточные слои (слизистые и нерастворимые вещества). Промывают раствор нейтрализованного масла в гексане или легком петролейном эфире последовательными порциями по 25 см раствора изопропилового или этилового спирта (5.1.3) до тех пор, пока розовый цвет фенолфталеина не исчезнет.

Переносят раствор в колбу ротационного испарителя (6.1.3) и выпаривают большую часть растворителя под вакуумом. Высушивают масло при 30-40°С под вакуумом в токе азота (5.1.7) до тех пор, пока растворитель не будет удален полностью.

8.2 Очистка пробы пропусканием через окись алюминия

Готовят суспензию из 15 г активированной окиси алюминия (5.1.6) в 50 см гексана или легкого петролейного эфира (5.1.2) и заполняют ею при постукивании хроматографическую колонку (6.1.2). Убеждаются, что окись алюминия ровно заполнила колонку, оставляют слой растворителя на 1-2 мм выше верхнего уровня адсорбента. Осторожно приливают в колонку приготовленный и нейтрализованный (если необходимо) раствор 5 г испытуемой пробы в 25 см гексана или легкого петролейного эфира (5.1.2) и собирают весь элюат в круглодонную колбу вместимостью 100 см (6.1.6).

Удаляют большую часть растворителя выпариванием в ротационном испарителе под вакуумом, затем высушивают масло при 30-40°С под вакуумом в токе азота (5.1.7) до тех пор, пока растворитель не будет удален полностью.

8.3 Гидролиз триглицеридов

8.3.1 Взвешивают навеску продукта массой (0,1±0,01) г очищенной испытуемой пробы (8.2) в центрифужную пробирку вместимостью 10 см (6.2.2). Если эта навеска не жидкая при комнатной температуре, помещают пробирку в ячейку водяной бани при температуре 60-65°С. Если при этом навеска не расплавится полностью, ее продолжают выдерживать в бане, но не более 10 с.

Вынимают пробирку из водяной бани и продолжают выполнять в быстрой последовательности испытания в соответствии с 8.3.2-8.3.5.

8.3.2 Добавляют к жидкой навеске предварительно взвешенные 20 мг липазы (5.2.6) и 2 см буферного раствора (5.2.5). Осторожно встряхивают и добавляют последовательно 0,5 см раствора холата натрия (5.2.3) и 0,2 см раствора хлорида кальция (5.2.4). Закрывают пробирку пробкой, осторожно встряхивают и сразу же помещают пробирку в ячейку водяной бани при 40°С, выполняя ручное встряхивание в течение (60±2) с. Все операции до начала ручного встряхивания должны быть выполнены за 30 с.

8.3.3 Извлекают пробирку из водяной бани и интенсивно встряхивают при 40°С в течение (120±2) с, используя встряхиватель (6.2.3).

8.3.4 Незамедлительно приливают 1 см соляной кислоты (5.2.2) и 1 см диэтилового эфира (5.2.1). Закрывают пробкой и интенсивно встряхивают на встряхивателе (6.2.3).

8.3.5 Центрифугируют содержимое центрифужной пробирки и переносят органическую фазу в пробирку для испытания с помощью шприца (6.2.5). Если проба была твердой при комнатной температуре, повторяют экстракцию с еще 1 см диэтилового эфира и объединяют экстракты в пробирке для испытания.

8.4 Отделение 2-моноглицеридов

8.4.1 Подготовка пластинок

Тщательно очищают стеклянные пластинки (6.3.3) этиловым спиртом (5.3.1), гексаном или легким петролейным эфиром (5.3.2) и ацетоном (5.3.3) до тех пор, пока жировые вещества не будут удалены полностью.

Взвешивают 30 г силикагеля (5.3.4) в коническую колбу вместимостью 250 см (6.3.10). Приливают 60 см воды. Закрывают пробкой и интенсивно встряхивают в течение 1 мин. Сразу же вносят суспензию в аппликатор (6.3.2). Наносят на очищенные пластинки слой толщиной 0,25 мм. Оставляют пластинки высыхать не менее чем на 1 ч на воздухе.

В любом случае, подготовлены ли пластинки способом, описанным выше, или приобретены готовыми, активируют пластинки в термостате (6.3.7) при 103°С в течение 1 ч. Перед использованием пластинки охлаждают до комнатной температуры в эксикаторе (6.3.13).

Для уменьшения скорости продвижения кислот пластинки с силикагелем должны быть пропитаны борной кислотой.

Испытуемая смесь должна быть разделена с помощью тонкослойной хроматографии как можно скорее.

В связи с тем, что некоторые силикагели содержат органические вещества, которые могут оказывать влияние на результаты в процессе хроматографического анализа, рекомендуется выполнять контрольное определение для того, чтобы убедиться, что силикагели не содержат таких веществ. В противном случае заранее очищают подготовленные пластинки, помещая их в хроматографическую камеру с растворителем (5.3.5) и дают растворителю подняться до верха пластинки.

Допускается применение других хроматографических пластинок, по техническим характеристикам не хуже указанных.

8.4.2 Отделение 2-моноглицеридов

С помощью микрошприца (6.3.4) на подготовленную пластинку (8.4.1) наносят экстракт (8.3.5) каплями в виде сплошной полосы, проходящей на расстоянии 15 мм от нижнего края пластинки.

Устанавливают пластинку в хроматографическую камеру (6.3.1), которая была предварительно насыщена парами разделяющего растворителя (5.3.5). Закрывают камеру крышкой и осуществляют хроматографирование веществ на пластинке до тех пор, пока фронт растворителя не достигнет уровня на расстоянии 10 мм от верхнего края пластинки.

Хроматографическое разделение проводят при температуре 20°С. Высушивают пластинку на воздухе при температуре 20°С и опрыскивают ее раствором индикатора (5.3.6), используя приспособление для опрыскивания (6.3.5). Отмечают полосу моноглицеридов (=0,035 приблизительно) в ультрафиолетовом свете (6.3.8) и соскребают ее микрошпателем (6.3.6), избегая попадания в нее компонентов с линии старта.

Если очищенные испытуемые пробы (8.2) были жидкими при комнатной температуре, помещают собранный силикагель в колбу для метилирования вместимостью 25 см (6.3.9) и выполняют операции, описанные в 8.5.

Если очищенные испытуемые пробы (8.2) были твердыми при комнатной температуре, переносят силикагель в коническую колбу вместимостью 50 см (6.3.11), содержащую 15 см диэтилового эфира. Интенсивно встряхивают и переносят содержимое на стеклянный пористый фильтр (6.3.12). Промывают фильтр троекратно, используя каждый раз порцию по 15 см диэтилового эфира, и собирают фильтрат в колбу для выпаривания. Выпаривают эфирный раствор до объема 4-5 см и переносят его в предварительно взвешенную круглодонную колбу вместимостью 25 см (6.3.9). Затем выпаривают растворитель в токе азота. Взвешивают остаток. Полученное количество моноглицеридов должно колебаться от 10 до 30% от массы испытуемой пробы. Если результат иной, повторяют гидролиз триглицеридов (8.2) или проверяют активность липазы (см. приложение А).